Занятие ТЕМА: «Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша»

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша»

I План занятия

I. Закрепить знания по изучению морфологии и биологии бордетелл и методов лабораторной диагностики коклюша и паракоклюша.

2. Овладеть методикой и техникой:

- приготовления и стерилизации тампонов для взятия материала при подозрении на коклюш;

- сбора материала при выделении бордетелл;

- проведения посева тампоном при выделении бордетелл;

- постановки тестов идентификации бактерий рода.Bordetella.

3. Закрепить практические навыки по технике микробиологических исследований

4. Познакомиться с нормативной документацией, регламентирующей микробиологическую диагностику коклюша и паракоклюша.

II Самостоятельная работа

Задание 1

Познакомьтесь с нормативной документацией, регламентирующей микробиологическую диагностику коклюша и паракоклюша.

1. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованию при коклюше и паракоклюше, Москва, 1983г.

2. Постановление № 14 от 20.10.2005г. «СаНПиН 2.17.14-20-2005 Правила обращения с медицинскими отходами».

Задание 2

I. Приготовьте КУА по прописи на этикетке в объеме 150 мл и разлейте в чашки Петри.

Способ приготовления: 50г порошка тщательно размешать в колбе с 1000мл холодной дистиллированной воды, простерилизовать 30 мин при 110⁰С или дробным методом. Среду остудить до 45-50⁰С, размешать не вспенивая и разлить стерильно в пробирки или в чашке при слоем 5-8мм. Повторное расплавление не рекомендуется.

2.Приготовьте по прописи на этикетке среду Симмонса в объёме 50 мл, разлейте в бактериальные пробирки и скосите, пользуясь ШСА.

3.Приготовьте по прописи на этикетке полужидкий агар в объеме 50 мл (1,2г на 100 мл дистиллированной воды), разлейте в бактериальные пробирки столбиком (высотой 1,5-2 см).

4.Приготовьте СПА с тирозином в объеме 100 мл.

Способ приготовления: на 100 мл дистиллированной воды добавляют 3,5 г сухого питательного агара; 0,1 г тирозина; расплавляют над пламенем горелки; разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 20-30 мин. Перед употреблением расплавляют агар с тирозином в пробирках на водяной бане, охлаждают до 45-50°С и скашивают, пользуясь ШСА.

5.Приготовьте бульон Хоттингера с мочевиной

Способ приготовления: к 100мл бульона Хоттингера (рН 7,0) добавляют 1г мочевины и 0,2мл 1,6% спиртового раствора крезолового красного. Стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 15 мин.

Задание 3

1. Приготовьте раствор пенициллина (можно использовать р-р бициллина) для обработки поверхности питательной среды и произведите обработку среды КУА.

Схема разведения пенициллина:

I пробирка - ИХН 9,9 мл + 0,1 мл основного разведения антибиотика

(500000 ME + I мл ИХН; I 000 000 ME + 2 мл ИХН); в I мл содержится 5 000 ME антибиотика;

II пробирка - ИХН 8,5 мл + 1,5 мл раствора из 1-ой пробирки; в I мл содержится 750 ME антибиотика;

III пробирка - ИХН 4,4 мл + 0,5 мл раствора из II-ой пробирки; в I мл содержится 75 ME антибиотика.

Способ обработки среды:из III-ей пробирки наносят 0,1 мл (7,5 ME) на поверхность питательной среды в каждой чашке, тщательно втирая шпателем

(как при посеве материала, например испражнений). Это делается для подавления роста посторонней микрофлоры при посеве исследуемого материала.

Примечание: Можно вносить раствор пенициллина в растопленный и остуженный КУА из расчета 25-50 ME на 100 мл среды (300 ME, т.е. 4 мл из III-ей пробирки добавляют на I мл среды, т.е. 30 ME на 100 мл среды).

Задание 4

Приготовьте и простерилизуйте заднеглоточный тампон для взятия материала при подозрении на коклюш.

Алгоритм

приготовления сухого тампона:

I. Ha один конец металлической, легкосгибающейся проволоки плотно наматывают слой гигроскопической ваты. Длина намотки должна быть 4-5 см (во избежание аспирации ваты).

2.Затем конец проволоки с намоткой ваты (1-2 см отступив от края) изгибают под тупым углом 110-120°.

3.Другой конец проволоки монтируют в корковую или ватную пробку.

4.Изготовленный тампон помещают в пробирку, заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве при 112° в течение 30 мин. или сухожаровом шкафу при 16О°С в течение I50 минут.

Примечание: Увлажненные тампоны готовят как и сухие. Стерильные тампоны перед употреб-лением смачивают в забуференной смеси путем двукратного погружения в пробирку с жидкос-тью. После смачивания тампон помещают в стерильную пробирку и используют для взятия материала. Увлажненные тампоны можно хранить в условиях холодильника в течение 3-х дней.

Задание 5

Изучите правила доставки материала и оформления направления при подозрении на коклюш.

Эти правила регламентированы "Инструкцией по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше" (1983г.):

1.При транспортировке (тампонов или чашек) материал следует оберегать от прямых солнечных лучей, сохраняя его в температурных пределах от +4°С до +37°С.Для чего рекомендуется помешать весь материал в специальные ящики биксы с защищающей прокладкой (марлевые ватники, грелки и др.).

2.На доставляемый в лабораторию материал должно быть оформлено направление, где указывается:

I. Наименование учреждения, направившего материал на исследование.

2. Ф.И.О., возраст и домашний адрес обследуемого.

3. Причина обследования.

4. Дата заболевания.

5. Дата и время взятия материала.

6.Число обследований.

7. Наименование материала и метод его взятия

8. Подпись лица, взявшего материал.

Задание 6

Произведите забор материала методом "кашлевых пластинок" (задание выполняется групповым методом).

Алгоритм забора материала:

1.Сбор материала производят на 2 чашки со средой КУА;

2.Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки, а правой подносят донышко чашки ко рту обследуемого на расстоянии 10-12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды.

З. Чашку в таком положении держат некоторое время (в течение 6-8 кашлевых толчков). При непродолжительном покашливании можно эту чашку поднести повторно.

Внимание! На питательную среду не должна попадать слюна, рвотные массы, мокрота.

Задание 7

I. Произведите забор материала (слизь из носоглотки) друг у друга заднеглоточным сухим тампоном.

Алгоритм забор материала:

I. Медработник левой рукой фиксирует с помощью шпателя корень языка обследуемого, а правой вводит в полость рта (загнутым концом вверх), продвигая его за корень языка. Тампон не должен касаться слизистой щек, языка и миндалин.

2.Концом тампона и выпуклой его частью касаются задней стенки глотки, проводя по ней справа-налево 2-3 раза.

3.Затем также осторожно над шпателем извлекают тампон из полости рта.

Примечание:

а) Забор материала увлажненным тампоном производят как и сухим.

б) При посеве материала с диагностической целью (от больного) рекомендуется использовать 2 чашки со средой КУА, а по эпидемическим показаниям (от контактных лиц)- I чашку.

в) Если ребёнок проявляет признаки беспокойства, то стоящий за его спиной помощник сзади фиксирует голову и руки ребёнка.

2.Сделайте посев материала, взятого тампоном, на чашку Петри с КУА, предварительно обработанную пенициллином.

Алгоритм посева материала:

1. Для получения изолированных колоний посев материала производят путем тщательного втирания его тампоном вначале по периферии среды чашки Петри в виде 4-5 площадок, а затем Z - образным штрихом в центре чашки.

Схема посева:

Примечание: Та же методика посева применяется на второй чашке.

2.Стерильным шпателем растирают центральную часть посева, не касаясь площадок.

3.Засеянные чашки помещают в термостат при t 35-37°С на 3 суток (72 часа), для увлажнения воздуха в термостат ставят открытый сосуд с водой.

Задание 8

Проведите III-й этап микробиологического исследования при выделении бордетелл:

I. Изучите морфологию выделенной чистой культуры, сделайте мазки из коклюшного и паракоклюшного диагностикума, зафиксируйте, окрасьте по методу Грама-Синева учите под микроскопом, зарисуйте в дневник и подпишите:

2.Изучите способность роста на простом агаре с тирозином и образование пигмента из тирозина, т.е. сделайте посев чистой культуры «бордетелл» на скошенный СПА с 0,1% тирозином → +37°С 24 часа.

3.Изучите характер роста культуры на среде с мочевиной, т.е. сделайте посев I петли чистой культуры в I мл бульона Хоттингера с мочевиной → 37⁰С 24 час.

4. Изучите утилизацию цитратов, т.е. сделайте посев чистой культуры на среду Симмонса →37°С 24 часа.

5.Изучите подвижность культуры, т.е.сделайте посев её в столбик полужидкого агара → 37°С 24 часа.

6.Проведите серологическую идентификацию выделенной чистой культуры, т.е. поставьте РА на стекле с коклюшным и паракоклюшным диагностикумами и со специфическими неадсорбированными коклюшной и паракоклюшной сыворотками, разведенными 1:10, а также с монорецепторными сыворотками к факторам I и 14 (для определения вида культуры) и к факторам 2 и 3 (для определения сероваров коклюшного микроба - 1.0.0; 1.2.0; 1.2.3;1.0.3).

Зарисуйте схемы РА на стекле в дневник, отметьте результат и сделайте заключение.

Задание 9

Изучите тесты дифференциации различных видов бордетелл.

Характеристика микробов рода бордетелла

Оценка ___________

Подпись преподавателя _____________