Занятие ТЕМА: «Микробиологическая диагностика дифтерии»

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика дифтерии»

I План занятия

I. Закрепить знания по изучению морфологических и биологических свойств коринебактерий и методов лабораторной диагностики дифтерии.

2. Познакомиться с нормативной документацией регламентирующей микробиологическую диагностику дифтерии.

3. Изучить правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала при дифтерии.

4.Овладеть методикой и техникой:

а) проведения этапов микробиологического исследования материала при выделении коринебактерий;

5.Научиться проводить учет тестов идентификации дифтерийных культур и выписывать ответ.

6.Закрепить практические навыки по технике микробиологических исследований

II Самостоятельная работа

Задание I.

Познакомьтесь с нормативной документацией регламентирующей микробиологическую диагностику дифтерии.

1. Приказ от 09.02.2000г № 42 «О мерах по профилактике дифтерии». Минск 2000г

2. Постановление № 14 от 20.10.2005г. «СаНПиН 2.17.14-20-2005 Правила обращения с медицинскими отходами».

Задание 2.

Изучите правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала при дифтерии.

От больных ангинами и больных с подозрением на дифтерию сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 часов (не позднее 12 часов) с момента обращения в ЛПО. Материал для исследования берут до начала лечения антибиотиками и другими антибактериальными препаратами. Материалом для исследования служат мазки из ротоглотки и носа. При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии помимо отделяемого из раны, слизистых оболочек глаз, из ушей или половых органов следует обязательно также брать материал из ротоглотки и носа

Материал забирается специально обученным медицинским персоналом. При бактериологическом обследовании с диагностической целью взятие исследуемого материала осуществляют сотрудники ЛПО, при обследовании по эпидемическим показаниям - сотрудники ЦГЭ или специально обученные бригады.

Для взятия материала используют стерильные сухие тампоны. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами: натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды, до лечебных и туалетных процедур, при хорошем освещении с использование шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с дужек мягкого неба, небного язычка и задней стенки глотки. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят поочередно в оба носовых хода, не касаясь крыльев носа снаружи. При наличии налетов, материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном, пытаясь проникнуть тампоном под налет. При крупе дифтерийной этиологии рекомендуется брать материал непосредственно у входа в гортань, при помощи тампона на согнутой под углом проволоке. При длительной транспортировке рекомендуется использовать транспортную среду или тампоны, смоченные до стерилизации 5% раствором глицерина. Необходимо обеспечить доставку материала в лабораторию в течение 2 часов, а при использовании глицериновых тампонов - в течение 4 часов. В холодное время года тампоны надлежит предохранять от охлаждения, в теплое - от высыхания: Использование питательных бульонов в качестве транспортной среды позволяет применить экспресс-методы выявления дифтерийного токсина для выдачи предварительного ответа (ИФА, РНГА).

Каждой пробирке с исследуемым материалом придается номер. В прилагаемом списке указывается следующая информация:

Данные о пациенте:

Имя, возраст, пол, название учреждения, домашний адрес обследуемого, фамилия лечащего врача.

Лабораторные данные:

Место взятия материала, дата и время взятия материала.

Клинические данные:

Симптомы и признаки, дата начала заболевания, лечение - антибиотики, антитоксин.

Эпидемиологические данные:

Больной, контактный или носитель; прививочный анамнез, предполагаемое место поражения, список контактных лиц.

Задание 3

Изучите морфологию и тинкториальные свойства коринебактерий по таблицам и путем микроскопии готовых «музейных» препаратов, зарисуйте мазки в дневник и подпишите.

Задание 4.

I. Приготовьте дифтерийные тампоны, градуированные пипетки, полоски фильтровальной бумаги и простерилизуйте их.

Алгоритм приготовления тампонов

I. Приготовьте 2 кишечных тампона (длина намотки ваты должна быть 4 -5 см), на одном из тампонов сделайте ватную пробку.

2.0ба тампона помещают в одну пробирку, заворачивают в бумагу и стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°С в течение I50 минут, или автоклавируют при 112°С в течение 30 минут.

II. Подготовьте градуированные пипетки к стерилизации и простерилизуйте их сухим жаром при 160°С в течение I50 минут.

III. Приготовьте из фильтровальной бумаги полоски размером 1,0 х 8см, заверните по несколько штук в бумагу (по 2 полоски) и простерилизуйте в сухожа­ровом шкафу при 160°С в течение I50 минут, или автоклаве при 120°С в течение 30 минут.

Задание 5

Приготовьте питательные среды:

1) среду Бучина по прописи на этикетке в объеме 150 мл, простерилизуйте и разлейте в стерильные чашки Петри.

2) среду ОТДМ по прописи на этикетке в объеме 150 мл, простерилизуйте и разлейте в чашки Петри.

3) сывороточный агар Леффлера: к 100мл расплавленной и охлажденной до 50⁰С питательной среды (СПА) добавляют 10 мл сыворотки крупного рогатого скота. Среду перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и устанавливают их в наклонном положении, стерилизуют свертыватель сыворотки при температуре 90⁰С 1 час.

4) транспортную среду: 0,1% СПА (100мг порошка на 100мл дистиллированной воды) разливают в пробирки по 3-5 мл, автоклавируют при 120⁰С 20мин. Перед употреблением в каждую пробирку соблюдая правила асептики добавляют 0,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и по 1 капле 2% раствора теллурита калия.

Задание 6.

Познакомьтесь со схемой лабораторной диагностики и типирования C.diphtheriae (см. Приложение № 2).

Проведите 1-ый этап бактериологического исследования материала при выделении коринебактерий дифтерии:

Алгоритм проведения 1 этапа:

1. Произведите забор материала (слизь из зева) друг у друга при помощи стерильного дифтерийного тампона без пробки.

а) зев должен быть ярко освещен и хорошо виден;

б) прижмите язык шпателем и возьмите материал из зева, не касаясь тампоном языка или внутренней поверхности щек.

в) слегка вращая и прижимая тампон, обязательно возьмите материал из налетов, белых пятен или участков воспаления. При наличии налетов постарайтесь из­влечь материал из-под краев, чтобы выделить бактерии, находящиеся в более глубоких слоях ткани.

2. Проведите посев взятого материала.

Ø Посев материала из ротоглотки, носа или других пораженных мест производят на две чашки Петри - с кровяным, а затем с теллуритовым агаром. Для экономии времени и материалов можно производить посев материала от одного лица на одну чашку (1/2 чашки - материал из зева, 1/2 чашки - из носа). При посеве материала из других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

Ø При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2x1 см², затем этим же тампоном или стеклянной сте­рильной палочкой засевают остальную поверхность. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии, непосредственно на чашке для дальнейшей идентификации. Засеянные чашки инкубируют при 37⁰С. Посев производят на среды, согретые при комнатной t или в термостате (15-20 мин).

3.Произведите забор материала (слизь из зева) у того же обследуемого при помощи второго дифтерийного тампона (с пробкой).

Ø Сделайте 2 мазка-отпечатка с этого тампона на 2-х предметных стеклах, высушите на воздухе, зафиксируйте над пламенем горелки и окрасьте один мазок по методу Леффлера (см. Алгоритм окраски МР № 4), а второй - по методу Грама-Синева (что позволяет определить другие возбудители ангины, кроме дифтерийной палочки: спирохеты, веретенообразные палочки, стрептококки и др.). Изучите мазки под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте предварительное заключение.

Заключение:

Ø Исследуемый материал на этом же тампоне засейте на полужидкую среду обогащения, опустив тампон с материалом в пробирку со средой и поставьте в термостат при 37°С на 18-20 часов.

Задание 7

Проведите 11-ой этап микробиологического исследования материала при выде­лении коринебактерий.

Алгоритм проведения 11-ого этапа

I. Отберите на чашке Петри со средой Бучина изолированную типичную для коринебактерий колонию и проведите её микроскопическое исследование, сделайте мазок из части колонии и окрасьте по методу Леффлера. Изучите мазок под микроскопом зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

2.Оставшуюся часть этой же колонии пересейте на среду Леффлера (Ру, скошенный 20% сывороточный агар) для выделения и накопления чистой культуры → 37°С 24 часа.

3.С типичными колониями ставят пробу на токсигенность → 37°С 24 часа.

Задание 8

Изучите биохимическую идентификацию некоторых микроорганизмов рода Corynebacterium (см. Приложение № 1) и демонстрационные тесты идентификации культур коринебактерий, учтите результаты по тестам и сделайте заключение (т.е. выпишите ответ).

I. Посев чистой "дифтерийной" культуры на коротком "пестром" ряде Гисса (ферментативных свойств коринебактерий).

Сахароза Глюкоза Крахмал Мочевина

Результат:"Выделенная культура

2. Посев чистой культуры коринебактерий в столбике среды Пизу (определения цистиназной активности)

Результат: «Выделенная культура

Среда Пизу

3. Посев чистой культуры коринебактерий в бульон с мочевиной (определение уреазной активности).

Результат: «Выделенная культура

Бульон с мочевиной

4. Определение пиразинамидазной активности (метод Colindale).

В стерильных пробирках с пробках, содержащих 0,25мл раствора пиразинамида, готовят «молочную» суспензию клеток испытуемой культуры и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 4 часов или ночи. После инкубации добавляют в каждую пробирку по 1 капле реактива для пиразинамида. В случае положительного результата раствор приобретает красно-оранжевую окраску. При отсутствии фермента раствор не окрашивается. Все потенциально токсигенны штаммы коринебактерий дают в этом тесте отрицательные результаты.

Результат: «Выделенная культура

Задание 9.

Проведите определение токсигенности выделенной чистой культуры, т.е. поставьте реакцию преципитации в геле с культурой и противодифтерийной антитоксической сывороткой или очищенным дифтерийным антитоксином (Алгоритм постановки РП см. МР № 16 ).

Зарисуйте чашку с пробой на токсигенность в дневник, учтите результат и сделайте заключение.

Результат: «Реакция преципитации в геле

Заключение: «Культура №

На основании полученных результатов выпишите ответ: «Выделена ….

Задание 10.

Изучите средства специфической терапии и профилактики дифтерии - демон­страция препаратов; запишите их названия в дневник и укажите назначение:

I. ___________________________________________ 3.___________________________________

2. __________________________________________ 4.___________________________________

Оценка ___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение № 1

Сравнительная характеристика морфологических признаков биоваров C.diphtheriae на кровяно-теллуритовых средах (48 час. инкубации при 37⁰С)

Биохимическая идентификация некоторых

микроорганизмов рода Corynebacterium

Приложение № 2

Схема

лабораторной диагностики и типирования C.diphtheriae

Посев на кровяной иПосев на кровяной и

кровяно-теллуритовый агары кровяно-теллуритовый агары

(18-48ч) (18-48ч)

Типичные колонииСреда

ГрамположительныеЛеффлера

палочки (6-18 ч.)

ПЦР, 6чСреда

Тест Элека, 18-48 ч Леффлера

Цистиназа, 24ч.

Уреаза, 4-24 ч

Цистиназа, 24ч.Чистая культура

Пиразинамидаза,

4-24 ч

Тест Элека, Биотипирование

18-48 ч