Главная Контакты В избранное
  • Занятие Тема: «Микробиологическая диагностика микозов».

    АвторАвтор: student  Опубликовано: 4-12-2020, 20:18  Комментариев: (0)

     


    Тема: «Микробиологическая диагностика микозов».

    I План занятия

    1. Изучите методы исследования используемые для диагностики микозов.

    2. Изучите правила взятия, хранения и транспортировки патологического материала, взятого из очага поражения при микозах.

    3. Отработайте навыки и умения:

    а) приготовление среды Сабуро;

    б) посева исследуемого материала для выделения грибов рода Candida;

    4. Закрепить практические навыки по приготовлению мазков и их окраски по методу Грама- Синева и Романовского - Гимзе.

    II. Самостоятельная работа

    Задание 1

    1. Изучите правила взятия, хранения и транспортировки патологического материала, взятого из очага поражения при микозах. (Методические рекомендации «Лабораторная диагностика грибковых заболеваний» от 25.02.1999 г. см. Приложение №1 МР № 49).

    Задание 2

    Изучите методы исследования используемые для диагностики микозов.

    ▪микроскопический метод;

    ▪культуральное исследование;

    ▪гистологический метод;

    ▪иммунологический метод;

    ▪биологический метод.

    1. Микроскопическое исследование патологического материала на грибы, производят в нативных и окрашенных препаратах. Предварительно его делят на три части: для микроскопии, для культивирования и повторного изучения.

    Для приготовления неокрашенных препаратов, патологический материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление материала с помощью различных средств, чаще всего едкой щелочью (КОН. NaOH или лактофенолом: 20 грамм молочной к-ты, 40 грамм глицерина, 20 мл дистилированной воды, 20 грамм карболовой к-ты, 0,5 грамм синьки, 10% водно-спиртовой р-р сульфида натрия), на материал наносят 1-3 капли 20-30% р-ра щелочи и осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли, не доводя до кипения. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха, и оставляют на 5-10 мин. (волосы, кожные чешуйки), 30-40 мин. (ногтевые чешуйки) для мацерации и просветления. Приготовленные препараты исследуют в течении 2 часов с момента приготовления.

    Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого его оставляют в 20%

    р-ре КОН на 30-60 минут.

    Для обработки грубых роговых масс применяют метод обогащения: материал в центрифужных пробирках заливают 1,5-2,0 мл КОН, кипятят в водяной бане 30-60 минут, затем центрифугируют 15 минут при 3000 оборотов в минуту или отстаивают одни сутки. После сливания жидкости осадок переносят на предметное стекло и проводят микроскопическое исследованиена обычном лабораторном микроскопе. Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. Вначале препарат исследуют на стекле при малом (8x), затем при большом увеличении (40x). Исследование нескольких препаратов повышает надежность анализа и позволяет избежать ложно- положительных результатов.

    Жидкий патологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в следующих просветляющих жидкостях: р-р Люголя (1г кристаллического йода, 2г йодистого калия, 150мл воды); смесь спирта с глицерином (этиловый спирт 1 часть, глицерин 2 части, дистиллированная вода 2 части), а также в физиологическом р-ре или воде.

    Для приготовления нативных препаратов на предметное стекло пипеткой или петлей наносят каплю материала, затем 1-2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

    Окраска препаратов из патологического материала проводится с целью идентификации возбудителя, а также наличия ответной воспалительной реакции организма. Для приготовления окрашенных препаратов мазки или отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют на смеси Никифорова, 96-градусном спирте или 10%-ном формалине. Полученные препараты окрашивают селективными методами для выявления грибов, а также готовят препараты, обработанные дополнительно гематоксилином (или по методу Романовского - Гимза). Из селективных методов наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу, ее модификации).

    Возбудители следует подразделять на PAS- положительные (жизнеспособные клетки патогенных грибов) иPAS – отрицательные ( возбудители псевдомикозов).

    Окраска патологического материала проводится в три этапа. На первом – патологический материал окрашивают PAS – методом (Шифф – йодная кислота). На втором - препараты следует окрасить по Граму. На третьем – применяются специальные методы окраски возбудителей: альцеаловый-синий – при подозрении на криптококкоз, импрегнация по Ганори-иГроккоту – на гистоплазмоз, реакция Бауэра – на пневмоцитоз, окраска по методу Циль-Нильсона – для выявления споробразующих дрожжей. В некоторых случаях целесообразно пасс-реакцию дополнить окраской световым-зеленым (0,2% -ный р-р), что облегчает обнаружение возбудителя, остающегося ярко окрашенным в красный цвет на светло-зеленом фоне окружающих клеток и тканей патологического материала. Окрашенные препараты подлежат микроскопированию с маслянной имерсией при увеличении 90x.

    2. Культуральное исследование. Необходимо проводить независимо от результатов микроскопии, так как культуральный метод позволяет в ряде случаев выявлять возбудителя при отрицательных данных микроскопии. Он дает возможность также определить род и вид возбудителя, что собственно важно для организации адекватной терапии и профилактики заболевания. Культуральный метод незаменим при диагностике латентных форм микозов, а также носительства дерматофитов здоровыми людьми. Получение культур грибов необходимо для определения чувствительности к антифунгальным препаратам.

    Исследование кожных и ногтевых чешуек осуществляется стерильной микологической лопаточкой, увлажненной в конденсате среды, чешуйки переносят в пробирку на скошенный сусло-агар в 2-3 точки, прижимая их к поверхности среды. Обычно посев делают в 2-3 пробирки с последующей инкубацией в термостате при температуре 28-370С до 5 дней.

    Отделяемое слизистых исследуется следующим образом: тампон помещают в пробирку с 2мл жидкой среды (сусло-, агара, среды Сабуро или МПБ) и встряхивают 5-7 минут, не замочив пробку. Затем готовят разведение 1:10, 1:100 и высеивают по 0,1 мл из каждого разведения на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробку с жидкой средой с тампоном инкубируют при температуре 370С в течение 48 часов, после чего производят подсчет числа колоний и ориентировано определяют количество дрожжевых клеток, взятых тампоном. Для этого количество выросших дрожжевых колоний умножают на 20 и на разведение. В случае отсутствия роста колоний на чашках из взятых разведений производят повторный высев из среды обогащения на 1 чашку с сусло-агаром.

    Посев отделяемого слизистых можно также делать, проводя тампоном с вращением по поверхности питательной среды. В данном случае количество дрожжевых колоний не учитывают, а отмечают только наличие и интенсивность роста: единичные колонии, значительный или сплошной рост, отсутствие роста дрожжевой флоры.

    Отделяемое свищей (гнойное, серозное) при наличии обильного отделяемого вначале исследуют микроскопически в нативных или окрашенных препаратах. Затем производят посев материала на агаровую среду (сусло лил Сабуро), для чего на чашку наносят 2-3 капли отделяемого и шпателем распределяют по поверхности очага. При малом количестве отделяемого производят только посев на те же питательные среды со следующей инкубацией в течение 48 часов при 370С.

    При описании колоний необходимо отметить такие признаки, как время ее появления, размеры, цвет поверхности и обратной стороны, характер поверхности и ее рельеф, форму и край колонии, ее консистенцию и наличие врастания в субстрат. При характеристике колонии указывают ее отличие от типичных штаммов, что важно для оценки полиморфизма данного вида гриба, а также для выявления атипичных штаммов.

    3. Микроскопическое исследование культур.Микроскопическое исследование культур производят в ряде случаев без приготовления микропрепаратов. При малом увеличении микроскопа и сильном освещении можно исследовать край колонии через стекло пробирки, так как нити мицелия перемещаются на него. Пробирка фиксируется рукой или используется деревянная подставка с вырезом.

    Для приготовления микропрепарата кусочек культуры расщепляют микологической лопаточкой и препаровальной иглой на предметном стекле в капле жидкости (вода, р-р Люголя) и накрывают покровным стеклом. Культуру для исследования берут из центральной и периферической зоны колонии. Микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении микроскопа. Элементы гриба измеряют с помощью окулярного микромера. При микроскопической характеристике культур учитывают септированность мицелия, наличие, характер и способ прикрепления макро- и микроконидий, структуру мицелия и его образования. Наличие и характер хламидоспор решающего значения не имеют.

    Задание 3

    1. Изучите методы приготовления питательных сред, используемых для культивирования грибов.

    ▪Среда Сабуро: 40г глюкозы, 10г пептона, 20г араг-агара, 0,5г левомицетина, до 1000 мл водопроводной воды. Все перемешивают, кипятят, разливают в стерильные флаконы, стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 15 мин.

    ▪Жидкое сусло: пивное сусло разводят водопроводной водой в равных количествах, разливают в колбы, автоклавируют при 1 атм. 20 мин.

    ▪Картофельный вода: тертый картофель (2г), заливают 100мл водопроводной воды и кипятят 15 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки, автоклавируют при 1 атм. 20 мин.

    ▪Картофельный агар: очищенный картофель режут на мелкие кусочки и заливают водопроводной водой из расчета 1л на 100гр картофеля. Кипятят 15 мин., фильтруют через 2 слоя марли, добавляют 10гр пептона, 18гр агар-агара, варят, доводят рН 6,6, разливают во флаконы, автоклавируют при 1 атм 20 мин.

    2. Приготовьте среду Сабуро про прописи на этикетке в объеме 200 мл, разлейте в стерильные чашки Петри.

    Задание 4.

    Проведите первый этап бактериологической диагностики кандидозов с целью выделения грибов рода Candida.

    Алгоритм проведения

    I этапа бактериологического метода диагностики кандидоза.

    ▪Исследуемый материал (чешуйки кожи, соскобы ногтей) помещают в пробирку с 5 мл жидкого сусло, посев помещают в термостат при 370С;

    ▪через 2-3 дня производят высев 0,1 мл на плотную среду Сабуро, тщательно рассеивая материал шпателем круговыми движениями по всей поверхности питательной среды.

    ▪проведите посев исследуемого материала, предварительно посеянного в жидкое сусло, на среду Сабуро.

    Задание 5.

    1. Изучите алгоритм проведения II этапа бактериологического метода диагностики кандидоза.

    Алгоритм проведения

    II этапа бактериологического метода диагностики кандидоза.

    ▪Через 2-3 дня при наличии роста колоний (непрозрачных в проходящем свете, белого или кремового цвета, с гладкой блестящей поверхностью, маслянистой консистенции) делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

    Если в мазках обнаружены дрожжевые клетки, то:

    ▪делают отсев нескольких колоний на среду Сабуро в пробирки для выделения чистой культуры гриба;

    ▪несколько колоний засевают на картофельный агар для дифференциации истинных дрожжей от дрожжеподобных грибов рода Candida. Посев делается в виде параллельных штрихов на чашку с агаром (лучше сеять лопаточкой, прорезая агар до дна чашки) и помещают в термостат на сутки при 370С.

    ▪подсчитывают число колоний, выросших на чашке, с учетом снятых. Техника подсчета обычная. Число выросших колоний умножают на число разведений (в данном случае на 5), так как делали посев в 5мл Сусло)с последующим умножением на 10 (посев разведен 0,1 мл). Например, в чашке выросло 60 колоний: 60х5х10=3000.

    2. Проведите микроскопическое исследование колоний со среды Сабуро, окрасьте мо методу Грама, зарисуйте в дневник, подпишите.

     

     

     

     

    Задание 6.

    1. Изучите алгоритм проведения IIIэтапа бактериологического метода диагностики кандидоза.

    Алгоритм проведения

    III этапа бактериологического метода диагностики кандидоза.

    ▪Через сутки посев на чашке с картофельным агаром изучают под микроскопом с опущенным конденсором и 8—кратным увеличением. Для этого чашку без крышки книзу дном помещают на столик микроскопа и изучают край штриха посева. Ровный край и четкая просматриваемость клеток округлой формы по ходу штриха свидетельствует о выделении дрожжевых клеток. Наличие у края мицелий в форме нитей, отходящий перпендикулярно от штриха, говорит о выделении дрожжеподобных грибов рода Candida.

    Для идентификации вида грибов рода Candida определяют:

    тип филаментации;

    наличие хламидоспор;

    изучают биохимическую активность (ферментацию углеводов).

    Ввиду того, что в составе дрожжевой флоры человека резко преобладает С.albicans, для быстрого диагностирования применяют диагностический тест-трубки прорастания:

    ▪для этого берется петля суточной культуры гриба и делается взвесь культуры в 0,5 мл дистиллированной воды;

    ▪каплю взвеси стерильной пипеткой наносят на поверхность плотной среды Сабуро и покрывают, фламбированным покровным стеклом. Чашку на 2-3 часа помещают в термостат при 370С;

    после чего посматривают под микроскопом. Если культура представляет собой С.albicans, то из отдельных бластоспор вытягиваются трубочки. Этот посев можно оставить при 370С для выявления псевдомицелия или при комнатной температуре – для выявления хламидоспор, которые имеют округлую форму, двухконтурную оболочку и зернистое содержимое. Хламидоспоры оборзуются на концах нитей и превосходят их по диаметру.

    Примечание: если выявлены "трубки прорастания” и хламидоспоры, дается ответ о выделении С.albicansи исследование прекращается.

    Культуры, не давшие хламидоспор, идентифицируют по комплексу признаков:

    внешнему виду колоний;

    характеру филаментации;

    ферментативной активности.

    Филаментация – способность образовывать псевдомицелии. Тип филаментации – зависит от характера расположения блатоспор на псевдомицели. У грибов рода Candida при почковании в местах сочленения псевдомицелия отпочковываются блатоспоры. Они располагаются группами, образуя гломерулы и вертициллы (мутовку – боковые ветвления).

    По характеру образующихся гломерул и мутовок различают 5 типов роста дрожжеподобнвх грибов Candida:

    Mycotorula – правильно расположенные шаровидные вертициллы и мутовки;

    Мycotoruloides – крыловидные вертициллы, неравномерно расположенные с обеих сторон псевдомицелия;

    Candida – овальные и круглые блатоспоры в местах сочленения псевдомицелия, где в последующем возникают гломерулы;

    Mycocandida – ярко выраженный псевдомицелий типа веток ели, блатоспоры круглые, гломерулы отсутствуют;

    Blastodendrion – псевдомицелий древовидный, состоит из полиморфных клеток, вертициллы отсутствуют.

    Посев для выявления типов ростаосуществляется на картофельный агар. Для успешного изучения филаментации необходимо использовать осветленный картофельный агар, разлитый в прозрачные тонкостенные чашки на глубину 2,5-3мм. Посев производят методом врезания в агар: микологическая лопатка с биомассой культуры погружается на 1/3 толщины агара, посев делается в виде двух сходящихся, но не пересекающихся лучей (в виде римской цифры IV). Посев выдерживают сутки при 370С, затем –при 250С. Филаментация образуется в толще агара по периферии посева – детали морфологии ветвления изучают при малом увеличении микроскопа.

    Биохимическую активность по ферментации сахаров у грибов рода Candida с целью идентификации вида изучают на среде Гисса с реактивом Андреде. Наиболее подходящей средой для ферментации углеводов считается пептонная вода (пептон – 10г, воды – 1000 мл с индикатором Андреде) слабощелочной реакции (рН 7,0-7,1). Среда разливается по стерильным пробиркам, на дне которых отверстием вниз находятся стеклянные трубочки-поплавки. Для проверки ферментации пригодны только те пробирки, поплавки в которых полностью заполнены питательной средой, пробирки с пузырьками воздуха в поплавках для работы не пригодны. Засеивают пробирки суточной агаровой культурой, внося ее обычной петлей или пастеровской пипеткой из взвеси их в физиологическом растворе. Посевы выдерживают в течение 15 дней в термостате, наблюдение за ростом и образованием кислоты и газа проводят каждые 5 дней. При разложении углеводов и связанном с этим подкислении среды бесцветная пептонная вода становится красной.

    Задание 7.

    Изучите краткую характеристику биологических свойств наиболее распространенных видов Candida (см. приложение №2).

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Оценка _____________________

     

    Подпись преподавателя____________________

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Приложение №1

    Правила сбора, хранения и транспортировки патологического

    материала при микозах.

    В дерматовенерологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат чешуйки кожи, волосы, ногти. В случае подозрения на глубокие и системные микозы возникает необходимость лабораторной диагностики на грибы мокроты, мочи, фекалий, гноя, отделяемого со слизистых оболочек, промывных вод, крови, кусочков органов и биопсированной ткани.

    Патологический материал необходимо брать в максимально возможном количестве из очагов, не подвергшихся местному лечению. В случае, если местное лечение антимикотиками имело место, очаги поражения следует вымыть с мылом или очистить спирто-эфирной смесью и производить забор материала через 2-3 дня.

    Перед взятием материала, кожа или ногти вымываются или протираются 700 этиловым спиртом, материал лучше брать из свежесформировавшихся очагов поражения.

    1. Кожные чешуйки снимают затупленным скальпелем с периферии очага, корочки – эпиляционным пинцетом. Для взятия материала с шелушащихся очагов на гладкой коже и у детей применяют прозрачную липкую ленту.

    2. У больных микозами волосистой части головы пораженные волосы извлекают эпиляционным пинцетом на пирефирии очага. Забор патологического материала производится под контролем лампы Вуда.

    3. Скутулы при фавусе удобно брать эпиляционным пинцетом, так как они очень богаты грибами во всех своих частях. Пушковые волосы извлекают вместе с чешуйкой.

    4. У больных с инфильтративно-нагноительной формой микоза волосистой части головы и области роста усов и головы, волосы для исследования берут вместе с гноем. Затем они помещаются на часовое стекло или чашку Петри для отделения гноя.

    5. Грубые роговые массы с подошв срезают скальпелем или лезвием безопасной бритвы.

    6. При паронихиях производят забор гноя из-под ногтевых валиков, при отсутствии гноя – соскабливают материал с соприкасающихся поверхностей ногтевой пластинки и валиков.

    7. Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном, который затем помещают в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2мл среды (сусло Сабуро). Соскобы налетов беловато-серого цвета со слизистых оболочек берут ложечкой Фолькмана или предметным стеклом.

    8. Кровь для исследования на грибы после взятия из вены (5-10мл) сразу переносят в колбу с жидкой питательной средой или равным количеством цитратом натрия.

    9. Биопсированный материал при необходимости исследования на грибы помещают в стерильную чашку Петри и используют для микроскопии посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

    Патологический материал можно помещать в стерильные чашки Петри, пакеты из черной бумаги (чтобы лучше видеть чешуйки и волосы), между двумя стерильными предметными стеклами, скрепленными резинками и завернутыми в бумагу. Полученный патологический материал доставляют в лабораторию в специальной таре или биксах.

    Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение часа после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или в течение 3-х часов при хранении в холодильнике при температуре 40С. В запаянных пробирках жидкий патологический материал сохраняется до высыхания довольно долго. Грибы в волосах и чешуйках, завернуты в бумажные пакеты, могут сохраняться месяцы и долгие годы.

     

     

     

     

    Приложение №2

    Краткая характеристика биологических свойств

    наиболее распространенных видов Candida.

     

    Вид гриба

    Морфология

    Характеристика роста на средах

    Ферментация углеводов

    Форма клеток

    Типы филаментации

    Особые признаки

    Плотные

    Жидкие

    Лактоза

    Глюкоза

    Мальтоза

    Сахароза

    Галактоза

     

    C.albicans

     

     

    круглые или оваль-ные

    Mycotorula Мycotoru-loides

    Хламидо-споры

    Гладкие, выпуклые, кремово-беловатые, мягкой консистенции

    Рыхлый осодок на дне, слегка мутный

    __

     

     

     

    КГ

     

     

     

    КГ

     

     

     

    К

    (+-)

     

     

     

    КГ

     

    C. tropicals

     

    овальн-ые

    Mycotorula Мycotoru-loides или Candida

    Хламидо-споры, псевдоко-нидии (+-)

    Морщинистые, беловато-серые, кожистые или крошковатые

    Кольцо, осадок, мутный бульон, на поверхности нежная серая пленка, переходит на стенки

    __

     

     

     

    КГ

     

     

     

    КГ

     

     

     

    КГ

     

     

     

     

    КГ

     

    C.pseudotropicals

     

    мелкие оваль-ные

    Чаще Mycocandi-da

     

    Плоские, с куполообразным центром, серые, сметанообразные

    Осадок, среда прозрач-ная

    КГ

     

     

     

     

    КГ

     

     

    __

     

     

     

    КГ

     

     

     

     

    КГ

     

    C.krusei

     

    слегка вытянутые

    Mycotorula Мycotoru-loides Mycocandi-da

     

    Плоские, гладкие, матовые, буровато-серого цвета

    Широкое кольцо, заползающее на стенки, осадок мутит среду

     

     

    КГ

    __

    __

    __

    __

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    скачать dle 10.6фильмы бесплатно