Тема: «Методы исследования образцов из стерильных локусов и материалов при аутопсии».

I План занятия

1. Изучить этиологию из образцов стерильных локусов и материалов при аутопсии.

2. Изучить правила отбора материала, хранение и транспортировки, подготовка материала к исследованию.

3. Освоить методику выделения и оценка результатов предполагаемых возбудителей из биологическогоматериала.

Задание 1

Изучите этиологию из образцов стерильных локусов и материалов при аутопсии.

Выделение микроорганизмов из образца, отобранного из стерильного локуса, с высокой долей вероятности является причиной воспаления в исследуемом биоптате. Наиболее частыми возбудителями плевритов являются: Staphylococcus aureus, Streptococcuspneumoniae, стрептококки группы А, энтеробактерии, бактероиды, актиномицеты, микобактерии. При перитонитах наиболее часто выделяют: энтеробактерии, энтерококки, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, анаэробные бактерии (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus) и другие микроорганизмы являющейся нормальной микрофлорой желудочно – кишечного тракта. Артриты и остеомиелиты могут вызывать Staphylococcus, Streptococcus, энтеробактерии, микобактерии.

Микробиологические исследования материалов при аутопсии проводят в случаях летальных исходов больных, умерших при наличии у них гнойно – воспалительных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. В зависимости от клинического диагноза и обнаруженных в процессе патологоанатомическихданных, материалом для микробиологического исследования служат кусочки органов и тканей, кровь, гной, экссудат и т.д.

Задание 2

Изучите правила отбора материала, хранение и транспортировки, подготовка материала к исследованию.

Плевральная, перитониальная, перикардиальная, суставная и другие жидкости. Отбор материала проводится с соблюдением правил асептики в стерильный контейнер или шприц в количестве не менее 1 мл для выделения бактерий и не менее 10 мл для грибов. Образец доставляется в лабораторию в течение 15 минут. Допускается хранение материала в течение 24 часов при комнатной температуре при использовании флаконов для гемокультур. Для бактериоскопии готовят не менее двух мазков.

Биоптаты внутренних органов и тканей. Отбор материала проводится с соблюдением правил асептики. Кусочек ткани объемом не менее 3-4мм отбирается в стерильный контейнер. Образец должен быть доставлен в лабораторию в течение 15 минут. Допускается хранение материала в течение 24 часов при температуре 4-6⁰С в стерильном физиологическом растворе не менее 1 мл. Для бактериоскопии готовят не менее двух мазков.

Материал при аутопсии. Основным условием для получения достоверных результатов и их правильной интерпретации является раннее, не позднее 12 часов после смерти больного, взятие материала, даже при хранении трупа при пониженной температуре. Наиболее приемлемым для микробиологического исследования принято считать отбор материала в течение 15 часов после смерти. Материал для микробиологического исследования берет персонал патологоанатомического отделения (врач, фельдшер - лаборант) с соблюдением правил асептики. Необходимые инструменты для проведения забора: платиновая (металлическая) петля, шпатель, скальпель, спиртовая горелка, бактериологические пробирки.

Пробы крови получают из левого желудочка сердца шприцем или пастеровской пипеткой. Непосредственно после взятия кровь в количестве 5-10 мл засевают во флаконы с 50-100 мл "двойной среды" и "среды для контроля стерильности". Край флаконов при посеве обжигают над пламенем спиртовой горелки.

Пункцию и биопсию проводят после обработки исследуемого участка 3% перекисью водорода и последующего удаления антисептика стерильным физиологическим раствором. С соблюдением правил асептики 2-3 кусочка органов или тканей, величиной по 0,5-1 куб. см помещают для транспортировки в стерильные чашки Петри или в пробирки.

Гной из вскрытых полостей, спинномозговую жидкость отсасывают шприцем и в количестве 1-5 мл помещают в стерильные пробирки. Поверхностные секреты собирают на бактериологический тампон.

Материал, взятый от трупа больного с гнойно - воспалительной патологией, вызванной условно - патогенными бактериями, должен быть доставлен в лабораторию в течение 1-2 часов. В направлении дополнительно указывают дату и время смерти, забора материала.

Из кусочков тканей, гноя и т.д. готовят мазки – отпечатки.

Задание 3

Изучите рекомендуемый перечень исследуемых материалов при различной инфекционной патологии.

Сепсис: кровь, легкое, селезенка, печень, гной с метастатическим абсцессом.

Пневмония:легкое, кровь, слизь из бронхов, абсцессы.

Перитонит: кровь, гнойный экссудат.

Раневая инфекция: кровь, экссудаты, гной, некротический детрит, метастатические абсцессы, регионарные лимфатические узлы, селезенка.

Менингиты:ликвор, гной из оболочек, ткань мозга с гнойным пропитыванием оболочек, легкое.

Инфекция мочеполового тракта: кровь, почки, экссудат.

Кишечные инфекция:содержимое толстой (тонкой) кишки, содержимое желчного пузыря, селезенка.

Задание № 4

Приготовьте питательные среды:

1. 5% кровяной агар: к расплавленному и охлажденному до 45ºC агару прибавляют 5% дефибринированной крови перемешивают и разливают в чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

2. Шоколадный агар: к 100 мл расплавленного и охлажденного до

80°С питательного агара добавте 10 мл дефибринированной крови человека,тщательно перемешайте, послечего помещайте вводяную баню и, постоянно встряхивая, держите при температуре 70°- 80°С до тех пор, пока цвет агара не станет шоколадным (25-30 мин.),разлейтев чашки Петри.

3.Среда Эндо по прописи на этикетках в объеме 100 мл и разлейте в чашки Петри.

4. Среда ЖСА расплавьте стерильный солевой агар на водяной бане, охладите до 45-50⁰С, добавьте 20% стерильной желточной взвеси, разлейте в чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

5. Агар Сабуро во флаконе расплавьте на водяной бане, охладите до 45-50⁰С и разлейте в чашки Петри.

6. Полужидкий сывороточный агар в объеме 50 мл и разлейте пробирки столбиком по 2-3мл.

7. Тиогликолевая среда по прописи на этикетке в объеме 50 мл и разлейте в пробирки по 5 мл.

8. Селенитовый бульон по прописи на этикетке в объеме 100 мл.

9. Среда ВСА по прописи на этикетке в объеме 100 мл и разлейте вчашки Петри.

10. Среда Китта – Тароцци (для выделения анаэробов).

11. «Двухфазная среда» (скошенный агар и бульон).

Задание № 4

1. Проведите бактериоскопию исследуемого материала не менее двух мазков (из биологических образцов стерильных локусов и биоптатов органов и тканей).

Алгоритм приготовления препаратов из биологических образцов стерильных локусов:

Для жидких непрозрачных биологических образцов, наносят каплю на предметное стекло вблизи от торца, перед каплей под углом 45⁰ стекло и плавным движением равномерно распределяют по поверхности.

Для прозрачных проб производится центрифугирование при 3000 оборотах в течение 5 минут, затем из осадка на поверхность предметного стекла наносится 1 -2 капли (не распределять по поверхности). Высушенные мазки зафиксируйте в пламени спиртовки и окрасьте один мазок по методу Грама - Синева, второй - при подозрении на туберкулез – по Цилю – Нильсену, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте предварительное заключение.

Заключение: Заключение:

Алгоритм приготовления препаратов из биоптатов органов и тканей:

Ткани предварительно размельчают на мелкие кусочки, добавляют 5 мл стерильного физиологического раствора и центрифугирование при 3000 оборотах в течение 5 минут, затем на поверхность предметного стекла наносятся 1 -2 капли супернатанта. Мазки высушите при комнатной температуре, зафиксируйте надпламенем спиртовки и окрасьте один мазокпо методу Грама - Синева, второй- при подозрении на туберкулез – по Цилю – Нильсену, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте предварительное заключение.

Заключение: Заключение:

2. Приготовьте мазки - отпечатки из исследуемого материала при аутопсии на предметном стекле, высушите на воздухе, зафиксируйте над пламенем спиртовки и окрасьте по методу Грама - Синева, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте предварительное заключение.

Заключение:

Примечание: При микроскопии отмечают степень обсемененности бактериями, морфологию и тинкториальные свойства микроорганизмов. В зависимости от результатов бактериоскопии, клинического диагноза и данных прижизненного микробиологического обследования вносят коррективы в ход исследования (расширяют набор питательных сред для первичного посева).

Задание № 5

1. Проведите первичные посевы исследуемого материала (из стерильных локусов). Стерильной пипеткой со дна пробирки берут 0,1 мл материала, засевают на питательные среды: 5% кровяной , шоколадный агар, среда Эндо, ЖСА, Сабуро, тиогликолевая, Китта – Тароцци. На чашках Петри материал тщательно втирают круговыми движениями шпателя по всей поверхности среды. Оставшийся материал используют для посева на среду обогащения (0,1 полужидкий сывороточный агар). 5% кровяной, шоколадный агар инкубируют при 35-37⁰С , 5-10% СО₂ - в эксикаторе со свечой в течение 24- 48 часов, среда Эндо при 35-37⁰С в течение 24 часов, среда ЖСА при 35-37⁰С в течение 48 часов, среда Сабуро при 22-25⁰С в течение 72 часов, тиогликолевая среда (для контроля стерильности) при 35-37⁰С в течение 7-10 дней, Китта – Тароцци в анаэробных условиях при 35-37⁰С в течение 7дней, 0,1 полужидкий сывороточный агар при 35-37⁰С в течение 48 часов. При отсутствии роста колоний в плотных питательных средах делают высев из среды обогащения на кровяной агар и шоколадный агар.

Оценка результатов

При отсутствии роста бактерий на 4 -11 сутки выдается отрицательный результат. При обнаружении бактерий указывается характер роста на первичных средах и средах обогащения.

2. Проведите первичные посевы исследуемого материала (при аутопсии).

Перед микробиологическим исследованием с кусочков органов и тканей стерильным инструментом удаляют поверхностный слой и свежими срезами делают отпечатки (площадь 2 см²) на плотных питательных средах.

Гной и экссудат наносят на среды пастеровской пипеткой, а поверхностные секреты - бактериологическим тампоном. Внесенный материал рассеивают петлей по всей поверхности питательной среды. Для подготовки к определению количества бактерий в ткани, а также при посеве на жидкие среды кусочки предварительно измельчают. Материал засевают на питательные среды: 5% кровяной (2 чашки), шоколадный агар, среда Эндо, ЖСА, Сабуро, Китта – Тароцци. Для выделения сальмонелл материал засевают 1:9 в селенитовый бульон, при 35-37⁰С на протяжении трех дней ежедневно производят высевы на висмут – сульфит агар. Оставшийся материал используют для посева на среду обогащения (0,1 полужидкий сывороточный агар). 5% кровяной, шоколадный агар инкубируют при 35-37⁰С , 5-10% СО₂ - в эксикаторе со свечой в течение 24- 48 часов, среда Эндо при 35-37⁰С в течение 24 часов, среда ЖСА при 35-37⁰С в течение 48 часов, среда Сабуро при 22-25⁰С в течение 72 часов , Китта – Тароцци в анаэробных условиях при 35-37⁰С в течение 7дней, 0,1 полужидкий сывороточный агар при 35-37⁰С в течение 48 часов. Флаконы с двуфазной средой – исследование на гемокультуру . Соотношении крови и питательной среды 1:10 и инкубация при 35-37⁰С в течение 7-10 дней. Флаконыс визуальной системой учета результатов, просматривают не реже одного раза в сутки на наличие признаков роста. Одновременно производят перемешивание жидкой фазы и орошение твердой питательной среды. Если имеется подозрение на наличие медленно растущих микроорганизмов на 8 сутки проводится пересев на кровяной агар. Условия культивирования определяется предполагаемым возбудителям. Инкубацию флаконов с кровью следует продолжить ещев течение 7 дней. При отсутствии роста на 8 и 15 сутки, соответственно, дают отрицательный ответ.

Оценка результатов.

Отрицательный результат исследования выдается при отсутствии роста на всех питательных средах в течение 3(соответственно 5 или 8 суток). При микробиологическом исследовании трупного материала от больных с гнойно - воспалительной патологией следует помнить, что возбудители гнойной инфекции являются условно - патогенными бактериями, представителями нормальной микрофлоры человека, населяющей все области, соприкасающиеся с внешней средой и способной к активной инвазии в кровь, органы и ткани уже в агональный период, в первые же часы после смерти людей и без какой-либо инфекционной патологии. Патогенные микроорганизмы, например сальмонеллы или микобактерии туберкулеза, не являются представителями нормальной микрофлоры человека, поэтому их присутствие свидетельствует о наличии инфекции. Трудности часто возникают при сопоставлении результатов культивирования с данными микроскопического исследования окрашенных по Граму гистологических срезов тканей. В срезах тканей грамположительные микроорганизмы обычно видны лучше, чем грамотрицательные. Поэтому, при интерпретации результатов микробиологического исследования трупного материала необходимо сопоставить полученные результаты с данными прижизненного обследования, с клинической картиной болезни, патологическими и гистологическими данными.

Оценка___________

Подпись преподавателя _____________