Главная Контакты В избранное
  • Занятие Тема: «Методы исследования крови и спинномозговой жидкости».

    АвторАвтор: student  Опубликовано: 4-12-2020, 20:14  Комментариев: (0)

     


    Тема: «Методы исследования крови и спинномозговой жидкости».

    I План занятия

    1. Изучить этиологию бактериемии, сепсиса, менингита.
    2. Изучить правила забора исследуемого материала при бактериемии, сепсисе, менингите.
    3. Освоить методику выделения из крови и спинномозговой жидкости предполагаемого возбудителя с последующей его идентификацией.

    4. Изучитьмеханизм и алгоритм постановкиреакции латекс - агглютинации в СМЖ.

    II. Самостоятельная работа

    Задание 1

    Изучите этиологию бактериемии, сепсиса, менингита.

    В норме кровь стерильна. Сепсис, бактериемию могут вызвать любые микроорганизмы, как патогенные, так и условно – патогенные. Микробиологическое исследование крови следует проводить при заболеваниях, характерной особенностью которых является лихорадка. Выделение микроорганизмов из крови при гипертермии, помогает подтвердить диагноз при менингитах, пневмониях, пиелонефритах, остеомиелитах, артритах, перитонитах, холециститах, энтероколитах, травмах, раневых повреждениях кожи и мягких тканей. Бактериемия может быть результатом различных хирургических манипуляций. Длительная бактериемия характерна для эндоваскулярных инфекций (эндокардит, инфицированная аневризма, тромбофлебит).

    Спинномозговую жидкость исследуют в случае предполагаемого менингита как первичного процесса, так и осложнения после черепно – мозговой травмы, нейрохирургической операции или наличия инфекционного очага в организме.

    Наиболее частыми возбудителями менингита у новорожденных являются: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus (групп B, D), Listeria monocytogenes. У детей раннего возраста: Neisseria meningitis, Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis.

    Менингококки и пневмококки сохраняют свое значение для взрослых людей, а гемофильная палочка в старших возрастных группах вызывает менингиты только при наличии предрасполагающих факторов: алкоголизм, наркомания, иммунодефициты. Листерии так же могут быть причиной менингитов в старших возрастных группах. В начальном периоде листериоза ликвор серозный, позднее – гнойный. В случае серозных менингитов следует в первую очередь исключить туберкулез.

    У лиц пожилого возраста и больных с иммунодефицитом менингит может быть как результатом инфицирования Neisseria meningitis, Streptococcus pneumonia, так и проявлением внутригоспитальной инфекции, вызванной Haemophilus influenza, Streptococcus pneumonia, Salmonella. Этиологическим фактором менингитов, развившихся после черепно – мозговой травмы или как осложнение после нейрохирургических операций, чаще всего являются: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens. Как правило, менингит вызывается только одним микроорганизмом.

    Задание 2

    Изучите правила забора исследуемого материала при бактериемии, сепсисе, менингите.

    Общие требования.

    1. Биоматериал должен отбираться:

    ·до начала антибиотикотерапии терапии или перед введением следующей дозы антибиотика с учетом времени его элиминации;

    ·непосредственно из очага инфекций либо биопробы, отражающих процесс в тех или иных органах и системах (бронхиальный секрет при пневмониях, моча при инфекциях МВП и др.);

    ·с соблюдением асептики, избегая контаминации посторонней флорой;

    ·в достаточном количестве для проведения исследования и помещаться в стерильную посуду.

    2. Доставляться в максимально короткие сроки (1,5-2 часа либо с применением транспортных сред).

    3. Необходимо правильно заполнять сопроводительные документы (направления).

     

    КРОВЬ

    Показания для проведения микробиологического исследования:

    ·клиническая картина сепсиса;

    ·лихорадочные состояния неустановленной этиологии;

    ·подозрение на инфекционные заболевания.

    При заборе крови необходимо соблюдать меры индивидуальной защиты от возбудителей инфекций, передающихся через кровь.

    Взятие исследуемого материала:

    - взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода;

    - до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата.

    Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики. Используют стерильные 20-граммовые (для детей 10-граммовые) шприцы с иглами для венопункции.

    Кровь берут у постели больного или в процедурном кабинете в первую очередь после УФ-облучения и тут же засевают на питательные среды. Данную манипуляцию необходимо проводить вдвоем: один медицинский работник проводит обработку кожи больного, венопункцию и взятие крови, второй, в это время открывает над пламенем спиртовки пробки флаконов со средами, подставляет их под струю крови из шприца, обжигает горла флаконов и закрывает их. Флаконы со средой необходимо хранить в холодильнике, а перед посевом (за 30-60 минут) выдержать при комнатной температуре. С момента посева и до транспортировки в лабораторию флакон также содержат при комнатной температуре.

    Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70оспиртом, затем 5% настойкой йода и опять спиртом, во избежание раздражения кожи. Венопункцию проводят после полного высыхания дезинфектанта.

    Производить забор крови из центральных венозных катетеров (кроме подозрения на катетерассоциированные инфекции) запрещается!

    Соотношение крови и среды должно быть 1/10 для устранения бактерицидного действия крови путем ее разведения. (Следует отметить, что увеличение объема засеваемой крови в значительной мере увеличивает вероятность получения положительного результата). Согласно отечественным нормативным документам кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл. При отсутствии флаконов со средой (в случаях крайней необходимости), разрешается производить забор крови в 20 мл. шприц, в который предварительно набирают 0,5-0,7мл. стерильного гепарина. Не снимая иглы, и надев колпачок, немедленно отправляют в лабораторию.

    Кратность взятия материала:

    ·При остром сепсисе – 2-3 образца крови, взятых отдельными венопункциями с интервалом 30 минут.

    ·При подостром течении – 3 образца крови с интервалом 15-20 минут в 1 день и через 24 часа еще 3 посева.

    ·На фоне антибиотикотерапии - по 2 посева в сутки 3 дня подряд.

    ·При лихорадке неясного генеза – 2 раза в течение 1 часа, затем по той же схеме через 24 и 36 часов

    Оценка диагностической значимости полученных результатов.

    Бактериологическая лаборатория при исследовании посевов крови выдает отрицательный ответ в случае, если рост микроорганизмов не обнаружен в течение 10 дней инкубации. Однако рекомендуется продолжать инкубацию посевов и после выдачи отрицательного ответа. Автоматизированные системы для индикации микробного роста в посевах крови на ряду с прямым посевом, используют коммерческие среды во флаконах с 2-х фазной средой Hi Combi, одноразовые флаконы со специальной средой для автоматизированной системы BacT / ALERT 3D.

    Это иногда позволяет обнаружить L-формы бактерий, микроорганизмы, рост которых угнетен вследствие проводимой терапии и т.д.

    Причиной сепсиса или бактериемии, особенно у ослабленных больных, могут быть любые микроорганизмы, включая условно-патогенные и даже сапрофитные виды. Однако, если обнаружение в крови патогенных микроорганизмов практически всегда свидетельствует об их этиологической значимости, то находки условно-патогенных и сапрофитных видов могут быть следствием контаминации крови в процессе ее взятия или случайного загрязнения посевов при дальнейшей работе с ними. При случайной контаминации крови чаще всего выделяются микроорганизмы, входящие в состав нормальной микрофлоры кожи или широко распространенные в окружающей среде: Staphylococcus epidermidis; Propionibacterium acnes; Clostridium spp.; Corynebacterium spp.; Acinetobacter calcoaceticus; Bacillus spp. и др. Причиной сепсиса они бывают, как правило, у ослабленных больных и у больных с иммуносупрессией.

    В пользу этиологической значимости выделенного микроорганизма свидетельствует его неоднократное выделение из крови или одновременное выделение из других видов исследуемого материала.

    Согласно рекомендациям ВОЗ подтверждением этиологической значимости является быстрое (в течение 48 часов) обнаружение микроорганизма.

    ЛИКВОР

    Показания для проведения микробиологического исследования:

    ·все случаи предполагаемого менингита;

    ·осложнения после черепно-мозговых травм, нейрохирургических операций.

    Взятие исследуемого материала:

    Ликвор получают путем люмбальной пункции, реже при пункции боковых желудочков мозга. Желательно взять материал сразу при поступлении больного в стационар, до начала лечения.

    Пункция и взятие материала проводятся с соблюдением всех правил асептики.

    Первую порцию ликвора берут в отдельную пробирку для проведения общего клинического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, собирают в стерильную центрифужную пробирку в количестве 1-2 мл. Ликвор рекомендуется наливать в пробирку шприцем без иглы.

    Нельзя касаться руками краев канюли, иглы, пробирки, класть пробку на нестерильные поверхности!

    Образец должен быть немедленно доставлен в лабораторию. Если это невозможно, в течение нескольких часов материал сохраняют в термостате при 37оС или в термосе. Во время транспортировки ликвор необходимо оберегать от охлаждения и перегревания, так как в противном случае некоторые микроорганизмы могут погибнуть. Для транспортировки используют изотермические емкости, грелки с теплой водой и т.д.

    Оценка диагностической значимости полученных результатов.

    Спинномозговая жидкость является стерильной средой, поэтому выделение любого микроорганизма должно расцениваться как положительный результат. Нахождение условно-патогенных микроорганизмов и сапрофитов, таких как стафилококки, микрококки, дифтероиды и др, может вызвать сомнение и расцениваться как загрязнение в момент взятия или посева пробы. В таких случаях большое значение имеют клинические данные. Бактериологическое исследование ликвора позволяет обнаружить при менингитах и абсцессах менингококков, пневмококков, стафилококков и стрептококков. Выявить туберкулезных микробактерий технически трудно. Бледную спирохету находят при сифилитических заболеваниях, при цистицеркозе - пузырьки. Можно обнаружить также ядрышки актиномикоза, перепонки и обрывки эхинококков. Повышение количества белка отмечается при многих органических заболеваниях. Самые высокие цифры свойственны экстрамедуллярным опухолям, более низкие наблюдаются при компрессиях воспалительной природы (арахноидиты), менингитах, нейросифилисе. Для гидроцефалии, наоборот, характерно низкое содержание белка. Степень помутнения оценивается по четырехбалльной системе. Максимальное количество глобулинов обозначается четырьмя плюсами. Клиническое значение глобулиновых реакций ограничено. Содержание сахара в спинномозговой жидкости уменьшается (гипогликоррахия) в остром периоде, а также при обострениях хронического оболочечного процесса микробной этиологии и восстанавливается с улучшением состояния. Для вирусных менингитов гипогликоррахия не характерна. Меняется при менингитах и концентрация хлоридов ликвора.

    Задание 3

    Приготовьте питательные среды, используемые для проведения первичных посевов крови с целью выделения гемокультуры:

    1. 10-20% желчный бульон в объеме 100 мл.

    Способ приготовления: к 90 мл стерильного СПБ добавляют 10 мл стерильной желчи (или 20 мл желчи к 80 мл СПБ).

    1. Среду Рапопорт в объеме 50мл.

    Способ приготовления: к 10% желчному бульону добавляют 2% глюкозы и 1% индикатора Андреде или 0,1% спиртового раствора(1,6%) бромкрезолового пурпурного. Разливают во флаконы по 50 мл, вставляют поплавки для обнаружения газа, (стеклянные трубочки помещают во флаконы открытым концом вниз). Стерилизуют 3 дня по 30 мин. текучим паром.

    При росте тифозных и паратифозных бактерий среда с индикатором Андреде краснеет, среда с бронкрезоловым пурпурным желтеет.

    1. Двухфазную среду в количестве 1 флакона.

    Способ приготовления: В плоский флакон со скошенным агаром наливают желчь как конденсационную воду в объеме 5 мл.

    1. 1% сахарный бульон в объеме 100 мл.

    Способ приготовления: К 100 мл СПБ добавляют 1г глюкозы. Стерилизуют при 0,5 атм 30 мин или 3 дня текучим паром по 30 мин.

    1. Водно-сывороточную среду.

    Способ приготовления: Водопроводную или дистиллированную воду (pH7,2-7,4) разливают в пробирки по 3-5 мл и стерилизуют при 1200С 30 мин. После этого в каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин. при 560С кроличью или баранью сыворотку в количестве не менее 1 капли на 1 мл среды.

    Задание 4

    Произведите первичные посевы крови с целью выделения гемокультуры на питательные среды с учетом вида предполагаемого возбудителя:

    Ø Сделайте посев 5 мл крови во флакон с 50 мл 10% желчного бульона для выделения тифо-паратифозных бактерий->370С 24 часа;

    Ø Сделайте посев 5 мл крови во флакон с 50 мл среды Рапопорт для выделения тифо-паратифозных бактерий ->370С 24 часа;

    Ø Сделайте посев 2 мл крови в желчь (5мл), налитую как конденсационная вода в плоский флакон со скошенным агаром. Вместо пересевов достаточно наклонять флакон так, чтобы желчь смочила поверхность агара. Так можно поступать с посевами ежедневно до получения роста на поверхности агара или окончания срока, принятого лабораторией для выдерживания посевов крови в термостате, но не менее 7 дней при t 370C;

    Примечание: желчь не только потому пригодна для культивирования тифозных бактерий из крови, что способствует их росту, но благодаря задерживающему действию на бактериофаг; кроме того, желчь препятствует свертыванию крови.

    Ø Сделайте посев 5 мл крови во флакон с 50 мл 1% сахарного бульона для выделения стрептококков, стафилококков, бруцелл-> 370С 24 часа;

    Ø Засейте по 20 капель крови в пробирку с 5 мл водно-сывороточной среды для выделении лептоспир-> 280С в течение трех месяцев; рост контролируют не реже, чем через 5-6 дней.

    Задание 5

    1.Изучите характер роста культуры на 10% желчном бульоне и среде Рапопорт и запишите в дневник:

    -на 10% желчном бульоне:

    -среде Рапопорт:

    2.Сделайте мазок из выделенной бульонной гемокультуры, окрасьте по методу Грама-

    Синева, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

    Заключение:

     

     

     

    3.Сделайте высев культуры из желчи (среды Рапопорт) на 2 сектора чашки Петри с ВСА-> 370С 48часа;

    Задание 6

    Отберите на чашке Петри с ВСА типичную для сальмонелл изолированную колонию и проведите выделение и накопление чистой культуры, запишите в дневник алгоритм посевов:

    1.

     

    2.

    Задание 7

    Составьте алгоритм и проведите III-ий этап бактериологического исследования выделенной гемокультуры:

    1.

     

    2.

     

    3.

     

    4.

     

    5.

     

    6.

     

    7.

     

    Задание 8

    1. Проведите биохимическое типирование выделенной гемокультуры и сделайте заключение.

    Результат:

     

     

     

    Заключение:

    2.С учетом данных биохимического типирования проведите серологическую идентификацию гемокультуры, зарисуйте схему идентификации в дневник и сделайте заключение.

    3.Учтите результат антибиотикограммы и выпишите ответ по результатам проведенного бактериологического исследования.

     

     

     

     

     

    Результат антибиотикограммы:

    -

    -

    -

    -

    -

    Заключение:

    Задание 9

    Изучите основной нормативный документ, регламентирующий микробиологическую диагностику менингококковой инфекции и бактериальных менингитов. (Приказ № 81 от 13.02 2006 года «Об утверждении Инструкции о методах микробиологической диагностики менингококковой инфекции и бактериальных менингитов»).

    Задание 10

    Изучите правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала, при менингококковых инфекциях (см. Приложение №1).

    Задание 11

    Сделайте мазок из спинномозговой жидкости, окрасьте по Граму в модификации Фортиса, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

    Алгоритм окраски мазков

    1. Окрашивают бумагой по Синеву 1-2 мин.

    2. Смывают краску раствором Люголя.

    3. Обрабатывают препарат раствором Люголя 1-2 мин.

    4. Смывают раствор Люголя йод-ацетоном 30сек.

    5. Препарат промывают водой.

    6. Докрашивают 1% раствором сафранина 2 мин.

    7. Препарат промывают водой, подсушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.

    Заключение:

     

     

    Задание 12

    Изучите алгоритм первичного посева патологического материала (спинномозговая жидкость), с целью выделения менингококков.

    Примечание: Перед посевом чашки, хранящиеся в холодильнике, должны быть подсушены и подогреты до температуры 370С в термостате.

    Алгоритм посева спинномозговой жидкости (СМЖ)

    1. Стерильно пастеровской пипеткой со дна пробирки, берут 0,3-0,5мл СМЖ и по 2-3 капли засевают на поверхность 4 чашек Петри, с подогретыми питательными средами:

    1 чашка – содержит менингококк-агар (без добавок) или сывороточный агар.

    2 чашка – содержит «шоколадный» агар;

    3 чашка – содержит кровяной агар;

    4 чашка – содержит агар Эндо.

    Посевы с менингококк-агаром, сывороточным агаром, «шоколадным» агаром ставят в термостат при t 370С на 18-24 часа и создают условия повышенного содержания СО2, в атмосфере термостата (для создания этих условий может использоваться: термостат - СО2инкубатор, разовые коммерческие газовые системы, эксикатор со свечей).

    Посевы с кровяным агаром и агаром Эндо инкубируют при t370С на 18-24 часа, в условиях обычной атмосферы.

    2. Оставшуюся в пробирке СМЖ используют для посева на среду «обогащения» (полужидкий сывороточный агар), для этого 0,5 мл жидкости засевают в 5 мл 0,1% полужидкого сывороточного агара, подогретого в термостате при t 370С.

    3. Для посева СМЖ на ряду с прямым посевом, используют коммерческие среды во флаконах с 2-х фазной средой Hi Combi, одноразовые флаконы со специальной средой для автоматизированной системы BacT/ ALERT 3D.

    Оценка результатов. Ликвор в норме стерилен. Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и чувствительности к антибиотикам. Культуру менингококков, выросшую на менингококк агаре или сывороточном агаре при температуре 37°С, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации, а также для определения чувствительности к антибактериальным препаратам.

    Задание 13

    Изучите механизм и алгоритм постановки реакции латекс - агглютинации. Для экспресс - диагностики используют метод латекс-агглютинации, основанный на выявлении специфических поверхностных полисахаридных антигенов бактерий в СМЖ, при этом используют коммерческие наборы для латекс-агглютинации. Метод латекс - агглютинации, позволяющий в течение 15 мин дать заключение об отсутствии или наличии в спинномозговой жидкости больного специфических антигенов. Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликворе и при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей. Предварительно спинномозговую жидкость необходимо прогреть в течение 5 мин при 100 °С и центрифугировать при 1500 - 2000 об./мин. Для проведения реакции используют прозрачную надосадочную жидкость.

    Ход исследования: одну каплю каждого латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору, добавляют 0, 3 мл спинномозговой жидкости (надосадочная фракция). Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту. Агглютинация в течение 2 мин с одним из латекс - диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена.

     

     

     

    Оценка_____________

    Подпись преподавателя: _____________

    Приложение №1

    Правила забора, хранения и транспортировки

    исследуемого материала, при менингококковых инфекциях

     

    Показания для проведения микробиологического исследования:

    ·с диагностической целью:

    - больные с клинически выраженной формой заболевания;

    - больные с локализованной формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты другой этиологии.

    ·по эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

    Для проведения достоверной бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением сроков доставки и условий транспортировки.

    Материал для бактериологических и серологических исследований доставляются в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в термоконтейнерах при температуре 37оС.

    При невозможности немедленной доставки и отсутствия специальных транспортных сред рекомендуется хранить его в условиях термостата при температуре 37о С не более 18 часов.

    Материал доставляется в следующем виде:

    1.ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 2,0 мл;

    2.ликвор и кровь в 0,1% полужидком сывороточном агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры: 0,5 мл ликвора засевают немедленно у постели больного в 5,0мл полужидкого сывороточного агара, подогретого в термостате при температуре 37º С;

    3.мазки ликвора для бактериоскопии;

    4.«толстая капля» крови для бактериоскопии;

    5. кровь в количестве не менее 2,0 мл для серологических исследований.

     

     

     

     

    скачать dle 10.6фильмы бесплатно