Занятие ТЕМА: «Микробиологическая диагностика туберкулеза»

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика туберкулеза»

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению видов микобактерий, особенностей их морфологии и биологии, методов лабораторной диагностики туберкулеза.

2. Изучить правила забора мокроты для бактериоскопического анализа и меры безопасности при работе с заразным материалом.

3. Изучить тесты идентификации микобактерий.

4. Овладеть методикой и техникой проведения бактериоскопического метода диагностики туберкулеза легких.

5. Закрепить практические навыки по технике микроскопического метода исследования.

II Самостоятельная работа

Задание 1

Изучите морфологию и тинкториальные свойства палочек Коха путем микроскопии музейных препаратов, по таблицам, зарисуйте в дневник и подпишите.

ОкраскаЧистая культура

по Цилю-Нильсену(расположение «косами»)

Задание 2

Изучите вид среды Левенштейна-Йенсена, Финна II, зарисуйте в дневник и опишите характер роста ВК на них.

средыФинна II

Левенштейна-Йенсена

Характер роста:

Задание 3.

Изучите правила забора, хранения и транспортировки мокроты для бактериоскопического исследования и меры безопасности при работе с заразным материалом – мокроты, на основании Приказа № 106 от 4.07.2002г. «О совершенствовании диспансерного наблюдения и выявления, больных туберкулезом в Республики Беларусь» (см. Приложение № 1, № 2 к МР № 44).

Задание4

Проведите бактериоскопическое исследование мокроты с целью диагностики туберкулеза легких (приготовьте из мокроты 2 мазка).

Алгоритм приготовления мазков

Микроскопическое исследование на туберкулез должно проводиться в отдельной комнате с соблюдением правил безопасности, поточности движения и обработки материала. В объединенных клинико-диагностических лабораториях для бактериоскопических исследований на туберкулез должно выделяться отдельное помещение. Стены, потолки и полы помещения, в котором проводится бактериоскопическое исследование, должны быть покрыты гладким, не адсорбирующим материалом, который можно легко мыть и дезинфицировать.

В помещении для микроскопии должно быть четыре зоны:

1. зона для приема и регистрации диагностического материала

2. хорошо освещенное место для приготовления и окраски мазков;

3. место для микроскопирования;

4. место для регистрации результатов исследований.

Поступающие, в лабораторию пробы для бактериоскопического исследования принимают на отдельном столе. Прием следует проводить в одноразовых перчатках. Необходимо проверить, нет ли повреждений баночек (трещин, сколов), случаев протечки материала на поверхности. В случае разбивания баночек во время транспортирования пробы подлежат уничтожению (автоклавирование или сжигание или кипячение). Необходимо продезинфицировать наружную и внутреннюю поверхность транспортного бикса тампоном, смоченным дезинфектантом, обладающим микобактерицидным действием.

Подробные сведения о каждом пациенте с описанием характера мокроты заносят в лабораторный журнал регистрации бактериоскопических исследований.

В журнале указывается:

Лабораторный номер, дата, ФИО, пол, возраст, полный адрес, название мед. учреждения, направившего пробу, причина исследования, диагностика, мониторинг, результаты бактериоскопии 1, 2, 3, подпись, примечание (если образец мокроты направлен на диагностическое исследование, поставьте значок «V» в графе «диагностика». Если образец мокроты направлен на контрольное исследование в процессе лечения, укажите регистрационный номер больного в графе «мониторинг»

Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые отмытые, обезжиренные в спирте или смеси Никифорова стекла без царапин и сколов.

Новые предметные стекла для очистки кипятят в 1% растворе питьевой соды, после чего промывают водой, затем в 1% растворе соляной кислоты и снова проточной водой, затем протирают насухо. Вымытые стекла хранят в стеклянных банках с притертой пробкой в 96⁰спирте или смеси Никифорова. Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее 24 - 48 часов. Их можно вынуть из спирта, вытереть досуха и сохранять в стеклянных банках.

Стекло подписывают тушью или восковым карандашом. Номер проставленный на стекле, должен соответствовать номеру исследования по лабораторному журналу регистрации бактериоскопических исследовании на КУМ.

Баночку (плевательницу) открывают медленно и аккуратно, избегая разбрызгивания мельчайших заразных капелек (аэрозоля мокроты). Обожженной в пламени спиртовки и охлажденной бактериологической петлей или сломанными концами деревянной палочки (новой для каждой порции мокроты} захватывают небольшое количество мокроты с гнойными комочками. Гнойный комочек мокроты распределяют на предметном стекле как можно более тонким сдаем на площади приблизительно 1 х 2 см. Мазок должен быть достаточно тонким, так как и противном случае он может быть смыт с предметного стекла в процессе промывки. На каждом предметном стекле делается не более одного мазка.

При приготовлении мазка петлю необходимо обжигать после каждой манипуляции в пламени спиртовки до тех пор, пока не станет красной. Перед обжиганием крупные частицы мокроты можно удалить с петли движением ее вверх-вниз во флаконе с песком и 70⁰С спиртом. Чтобы предупредить разбрызгивание заразного материала при обжигании петли, рекомендуется нагревать ее начинать с конца впаянного в держатель, постепенно передвигая в пламени до появления дыма на ее загнутом кончике. После этого петлю можно прокалить в вертикальном положении до покраснения. Приготовленные мазки подсушивают при комнатной температуры в течение 15 мин. Высушенный мазок фиксирует 3-х кратным проведением его 3-5 сек через среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки до исчезновения признаков запотевания стекла. Не допускается фиксация сырых мазков.

Задание 5

Окрасьте приготовленные мазки по методу Циля-Нильсена, для подсчета КУМ.

Алгоритм окрашивания мазка по методу Циля-Нильсена

I. Мазок накрывают фильтровальной бумагой и на всю поверхность бумаги наносят карболовый фуксин Циля. Медленно нагревают стекло с мазком над пламенем спиртовки до появления пара. Не допускается кипение или высушивание окрашивающего раствора на предметном стекле. Если раствора недостаточно, его нужно добавить ешё и нагретъ второй раз.

2. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 мин., после чего фильтровальную бумагу удаляют пинцетом и помещают её в бачок для сбора отходов. Предметное стекло аккуратно ополаскивают под слабой струей воды из водопроводного крана, каждое отдельно, до полного удаления окрашивающего раствора. Мазок смывают ребром к струе. Не разрешается смывать и обесцвечивать одновременно несколько мазков во избежание перекрестного заражения.

3.Стекла помешают на мостик и обрабатывают каждое индивидуально 25% раствором серной кислоты.

4.Смывают -каждое предметное стекло как описано выше.

5.Обрабатывают каждый мазок индивидуально 96° этиловым спиртом 5 минут.

6.Промывают водой, как описано выше.

7.Обесцвеченные, промытые стекла с мазками обрабатывают 0,3% метиленовой синькой в течение 60 секунд.

8.Промывают водой, как описано выше, оставляют сушить на воздухе.

Примечание:

1.Для исследования окрашенных мазков необходимо исследовать не менее 100 микроскопических полей зрения с иммерсионным объективом в течение 5 минут. Если туберкулёзные бактерии не обнаружены в 100 полях зрения, необходимо тщательно исследовать новые 100 полей. В сомнительных случаях просматривают весь мазок.

2.Туберкулезные бактерии - маленькие красные палочки, слегка изогнутые, более или менее зернистые, изолированные, парами, группами, хорошо видны на голубом фоне мазка.

Подсчитывают количество кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

Регистрация результатов с указанием количества обнаруженных КУМ проводит следующим образом:

Примечание:

Количество обнаруженных КУМ, определяет тяжесть заболевания и опасность больного для окружающих. Мазок с обнаруженными КУМ является документом от которого зависит постановка диагноза туберкулеза легких у определенного человека. Его следует хранить в лаборатории, а результаты необходимо подтвердить повторным исследованием. Положительные мазки помещают в специальный ящик и хранят в течение года. Затем мазки обеззараживают погружением в дез. раствор, кипячением или автоклавированием и вывозят на свалку.

В лаборатории ведется журнал регистрации всех анализов мокроты

III Изучите оба препарата под микроскопом и сделайте заключение.

Результаты микроскопического исследования:

Заключение:

ЖУРНАЛ РЕГИСТРАЦИИАНАЛИЗОВ МОКРОТЫ,

поступающих на исследование в лабораторию

Задание 6.

Изучите тесты идентификации микобактерий туберкулеза и запишите их в дневник.

Задание 7.

Изучите автоматизированные системы, используемые для диагностики туберкулеза, (см. наглядное пособие «Современные методы диагностики микобактерий туберкулеза») и запишите в дневник.

Оценка ___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение № 1

правила забора мокроты для бактериоскопического исследования

Мокрота собирается в специальные стеклянные баночки емкостью около 50 мл с герметически завинчивающимися крышками, доставляется для исследования в лабораторию. Для сбора мокроты могут применяться также плевательницы из темного стекла с герметически завинчивающимися крышками, которые, как и баночки, используются многократно после мытья и стерилизации кипячением в течение не менее 30 минут. Необходимо использовать баночки с широким горлышком (диаметр не менее 35 мм), чтобы пациент мог легко собрать мокроту без контаминации наружной поверхности баночки. Мокроту можно собирать также в одноразовые плевательницы, которые после использования подлежат уничтожению. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состояние собранного материала, не открывая крышку баночки.

Сведения о пациенте приводятся на бумажной этикетке, прикрепленной на наружную стенку баночки или плевательницы. В этикетке указывается фамилия, имя, отчество, год рождения, дата забора мокроты, адрес больного и наименование медицинского учреждения. На исследование направляются три пробы мокроты от каждого пациента. Лучше использовать утреннюю порцию мокроты.

Первая проба. Мокрота собирается при первичном обращении пациента в больницу или поликлинику (утром) под наблюдением медицинского работника.

Вторая проба. Мокрота собирается больным в тот же день с промежутком в 1,5-2 часа после взятия первой пробы в присутствии медицинского работника.

Третья проба. Мокрота собирается самим больным утром следующего дня и доставляется им в лабораторию.

Можно рекомендовать следующую методику сбора трех образцов мокроты:

первый образец - при первичном обращении больного в медицинское учреждение;

второй образец, собранный рано утром на следующий день после первого обращения больного;

третий образец - непосредственно в медицинском учреждении, когда пациент принесет на исследование собранный утром второй образец мокроты.

Во время продуктивного кашля образуется аэрозоль, содержащий туберкулезные микобактерий. В целях обеспечения мер безопасности при откашливании мокроты пациентом и предупреждения инфицирования потенциально заразными аэрозолями медицинского персонала сбор мокроты должен осуществляться в специально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, локальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты. Если условия этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет других людей, под контролем медицинского работника. В любом случае нельзя собирать мокроту в замкнутых помещениях.

Собранные образцы мокроты от одного пациента не объединяют в одном сосуде, а направляют лабораторию с указанием сведений о пациенте для каждой пробы.

Сразу после взятия материал для исследования должен быть доставлен в лабораторию. Если транспортировка откладывается, собранную мокроту следует хранить в холодильнике при 4°С не более 2-х дней или в консерванте (3-5 суток)

Для хранения и перевозки мокроты необходимо использовать специальные, контейнеры, металлические биксы.

Биксы, в которых находятся плевательницы с мокротой, до перевозки следует хранить в холодильнике. Если у больного мало мокроты, можно использовал мокроту, собранную в течение суток, при условии, что она будет храниться в холодильнике. При этом ни в коем случае нельзя допускать ее замораживания

При необходимости посева мокрота собирается в стерильную плевательницу и сохраняется в холодильнике не более 1 дня

При отсутствии возможности доставить мокроту в медицинское учреждение можно приготовить хорошо зафиксированные мазки и переправить их в лабораторию в ряде случаев, когда больному трудно откашлять мокроту, прибегают к специальным методам, например стимуляции выделения мокроты. Мокрота, собранная после специальной стимуляции, по внешнему виду напоминает слюну поэтому такой направляют в лабораторию со специальной маркировкой («индуцированная мокрота»).

Меры безопасности при работе с инфекционным материалом

Каждый мед. работник отвечает за собственную безопасность и безопасность своих коллег по работе.

Весь персонал должен работать в медицинском халате, застегивающемся сзади, медицинском колпаке. При работе с инфекционным материалом необходимо пользоваться с резиново-клеенчитым передником, резиновыми перчатками, точно выполнять технические приемы и соблюдать меры предосторожности, предусмотренные правилами исследования.

Матерчатые или бумажные лицевые маски (например, хирургические) не обеспечивают защиту медработника от вдыхания взвешенных в воздухе капельных частиц, содержащих инфекционный агент. (используют 8-ми слойную марлевую повязку.)

При работе с мокротой следует сводить к минимуму выполнение лабораторных манипуляций, которые создают инфицирующие аэрозоли (мельчайшие капельки мокроты). К появлению аэрозолей в лаборатории приводит:

Øоткрывание плевательниц с мокротой, что особенно опасно в тех случаях, когда мокрота затекла и высохла между крышкой и стенкой плевательницы, или если мокроту взбалтывали пред открыванием плевательницы;

Øприготовление мазков на предметных стеклах;

Øпрожигание бактериологических петель, используемых для переноса материала на стекло;

Øпопытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала.

В целях максимальной защиты лаборантов от заражения необходимо приготовление и фиксацию мазков проводить в настольном вытяжном шкафу.

Микроскопию мазков проводить отдельно от места приготовления и окраски мазков. В лаборатории необходимо иметъ раковину с проточной водопроводной водой, систему вытяжной вентиляции и использование бактерицидных лампы ультрафиолетового облучения.

Запрещается принимать пищу и курить за рабочим столом.

Манипуляции следует выполнять только на лотке, который необходимо стерилизовать каждый день после использования либо огнем, либо обработкой 5% раствором хлорамина (либо другим средством).

Во время приготовления мазков окна и двери должны быть закрыты. Случайно залитые или забрызганные заразным материалом места на столах, полу и пр. необходимо немедленно залить дезинфицирующим раствором и оставить его на месте в течение не менее 1 часа, включить вытяжную вентиляцию, покинуть комнату.

После прикосновения руками к заразному материалу необходимо немедленно их дезинфицировать. Это надо делать также перед уходом из лаборатории.

Поверхности столов и лотков смачиваются дезраствором и оставляются в таком состоянии на 6 часов, a затем промываются теплым 2% содовым раствором.

По окончании манипуляций с заразным материалом предметы подлежат немедленной дезинфекции (погружаются или заливаются 5% хлорсодержащим раствором на 4 часа). После окончания препарирования окна и двери должны быть открыты для проветривания.

Баночки или плевательницы с мокротой складывают в бак или ведро для обеззараживания. Лабораторную посуду, бывшую в употреблении, дезинфицируют путем кипячения в течение 30 минут_с_момента закипания в мыльно-содовом растворе. Во время нагревания плевательницы должны быть полностью покрыты кипящей жидкостью. После кипячения лабораторную посуду моют для повторного использования. Возможна также дезинфекция лабораторной посуды путем автоклавирования или путем погружения в один из дезрастворов. Пинцеты, сушилки, мостики, кюветы обрабатывают пламенем или заливают дезинфицирующим раствором (5% раствор карболовой кислоты или 5% раствор хлорамина, или 2.5% активированный хлорамин).

Транспортировочные коробки или биксы очищаются ватными тампонам, пропитанными дезраствором.

После окончания работы перчатки персонала и пинцеты кипятят в течение 15 минут с момента закипания в кастрюле в 2% содовом растворе.

Халаты, полотенца. маски обеззараживают путем замачивания, в. 5% растворе хлорамина в течение 4 часов (5 литров раствора на 1 кг белья) или в 1% активированном растворе хлорамина в течение 2 часов. После этого белье кипятят около 30 минут, а затем стирают обычным способом.

примечание: вместо хлорамина используются любые дез. средства имеющиеся в лаборатории, которые обладают туберкулоцидным действием (время экспозиции дез. средства – см. наставление по применению данного дез. средства).

Приложение №2

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА

Для успешного выделения культуры возбудителя необходимо максимально сократить интервал от момента получения биологического материала до начала его иссле­дования. Поэтому полученные образцы следует направлять в лабораторию с минимальной задержкой. Если есть возможность хранить собранные пробы мокроты в холодильнике, то можно направлять их в лабораторию один раз в неделю. Однако другие виды биологического материала следует пересылать в лабораторию как можно быстрее.

Если транспортировка будет осуществляться при температуре окружающей среды, необходимо использовать химические консерванты. Удовлетворительные результаты культурального исследования могут быть получены при использовании следующих приемов:

vСмешать свежесобранный образец биологического материала с равным объемом 1 % раствора цитилпиридинхлорида в 2% растворе хлористого натрия. В этих условиях микобактерии туберкулеза сохраняют жизнеспособность до 7 дней, а рост контаминирующих микроорганизмов будет ограничен.

vСмешать свежесобранный образец биологического материала с безводным карбонатом натрия - из расчета 50 мг реактива на 2 мл биологической жидкости.

vЕсли задержка материала до отправки его в лабораторию на культуральное исследование составит менее 24 часов, собранный материал можно смешать с равным объемом 23% раствора трехзамешенного фосфорнокислого натрия.

Однако ни один из перечисленных методов консервации не является оптимальным, поэтому для получения хороших результатов следует направить собранные пробы в бактериологическую лабораторию как можно быстрее.

Требования и рекомендации по безопасной транспортировке биологического материала изложены в различных национальных и международных практических руководствах и инструкциях. Кроме того, в большинстве стран у почтовых работников и транспортников, включая Ассоциацию авиаперевозок, имеются специальные инструкции по перевозке таких материалов.

Единым требованием является то, что биологический материал должен быть надежно упакован для предупреждения его вытекания из контейнера при ударах, повышении давления и в других ситуациях. Прежде всего, биологический материал, пересылаемый по почте или авиатранспортом, помещают в стандартный прочный герметично закрытый контейнер, который затем упаковывается во второй контейнер, сделанный из металла, дерева или прочного картона и содержащий достаточное количество абсорбирующего материала (чтобы при повреждении внутреннего контейнера вытекающая жидкость полностью абсорбировалась этим материалом). Для пересылки биологического материала в другие страны эта коробка должна быть соответствующим образом упакована в наружный контейнер, а пересылка должна быть надлежащим образом оформлена в почтовом и транспортном управлении.

В бактериологические лаборатории, проводящие исследования на туберкулез, чаще всего направляют пробы мокроты, для пересылки которых необходимо иметь специальные транспортные ящики, изготовленные из дерева или металла должно помещаться от 20 до 30 флаконов с мокротой, которые устанавливают вертикально, чтобы предупредить вытекание биологического материала. Такие ящики должны плотно закрываться крышкой, желательно - на замок. При транспортировке ящики должны храниться в наиболее холодном месте и быть защищены от солнечных лучей.

Бланки направлений на лабораторное исследование должны находиться отдельно от флаконов с материалом. Для каждого транспортного контейнера должен быть подготовлен сопроводительный документ, в котором приводят сведения о пациентах и материале, взятом от них. Перед отправкой материла из лечебного учреждения должно быть проверено следующее:

Øколичество флаконов в ящике и указанных в сопроводительном документе совпадает;

Øидентификационный номер каждого флакона соответствует номеру в сопроводительном документе;

Øсопроводительный документ содержит всю необходимую информацию о каждом пациенте;

Øв сопроводительном документе указана дата отправки и приведены данные о медицинском учреждении.