Заянтие ТЕМА: «Микробиологическая диагностика бруцеллеза и сибирской язвы»

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика бруцеллеза и сибирской язвы»

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению морфологии и биологии бруцелл и бацилл сибирской язвы и методов микробиологической диагностики бруцеллеза и сибирской язвы.

2. Изучить правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала при подозрении на бруцеллез и сибирскую язву.

3. Изучить питательные среды, используемые для выделения бруцелл и бацилл сибирской язвы, и тесты их идентификации, тесты дифференциации бацилл сибирской язвы с антракоидами и почвенными бациллами.

4. Овладеть методиками и техникой постановки реакции Хеддльсона и реакции Райта при диагностике бруцеллеза.

5. Овладеть методикой и техникой проведения микробиологической диагностики сибирской язвы.

II Практическая работа

Задание 1.

Приготовьте мазок из бруцеллезного диагностикума, окрасьте по методу Грама-Синева, изучите под микроскопом, зарисуйте его в дневник и подпишите.

Задание 2

I Изучите элективные среды, используемые для культивирования и идентификации бруцелл – демонстрация сред; зарисуйте чашки и пробирки в дневник и подпишите.

1 2 3 4 5 6

II Изучите способы приготовления питательных сред, используемых для выделения и идентификации бруцелл:

1. Эритрит - агар

Способ приготовления: 36г препарата размешать в 1л дистиллированной воды, кипятить 2-3 мин до полного расплавления агара, профильтровать и простерилизовать автоклавированием в течение 20мин при t⁰ 121⁰С. Среду охладить до 45-50⁰С, разлить в стерильные чашки Петри.

2. Бруцеллагар

Способ приготовления: 45,5г порошка размешать в 1л дистиллированной воды, кипятить 1-2 мин до полного расплавления агара, фильтровать через ватно-марлевый фильтр, разлить в стерильные флаконы и стерилизовать автоклавированием при t⁰121⁰С в течение 15 мин. Среду охладить до 45-50⁰С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при 37±1⁰С в течение 40-60 мин.

3. Печеночный агар и печеночный бульон

Способ приготовления: Фарш из свежей говяжьей печени заливают водой (1л на 1 кг фарша), настаивают 3 часа при 25-30⁰С или 6-10 часов при 4-10⁰С, затем варят около 2 часов; после варки настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при t⁰115-120⁰С 20 мин.

Для получения печеночного бульона настой разводят водой 1:1, добавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия.

При приготовлении печеночного агар дополнительно вносят 2-2,5% агар-агара; рН среды должен быть 7,1-7,2.

4.Мясо-печеночно-пептонный агар в пробирках

(рН 6,6) Под пробку пробирок помещают полоски фильтровальной бумаги, пропитанные насыщенным раствором ацетата свинца; они служат для дифференциации бруцелл по выделению сероводорода. Обильное и длительное образование сероводорода характерно для Br. abortus bovis. Культуры Br. melitensis не образуют сероводород.

5. Полужидкий агар

Способ приготовления: мясной воды 500мл, дистиллированной воды 500мл, натрия хлорида 5г, пептона 2г, агара 2г. Стерилизуют 20 мин. при 1,5 атм, рН 6,8-7,0.

К 100мл расплавленного и остуженного до 45⁰С агара прибавляют 4 мл основного раствора тионина из такого расчета, чтобы получить разведение красителя 1:25 000; если применять фуксин, то надо прибавлять основной раствор из расчета разведения красителя 1:50 000.

Агар с красителями разливают по 4 мл в пробирки и проверяют на стерильность 2 суток в термостате.

Среду используют для выделения бруцелл из бактериально загрязненного материала. Кроме того, по бактериостатическим свойствам можно дифференцировать виды бруцелл по разной их устойчивости к анилиновым красителям.

6. СПА и скошенный СПА

Способ приготовления: расплавьте стерильный СПА во флаконе на водяной бане, охладите до 45-50⁰С и разлейте в стерильные чашки Петри и бактериальные пробирки; пробирки скосите, пользуясь ШСА.

7. 5% кровяной агар

Способ приготовления: к 100 мл расплавленного на водяной бане и охлажденного до 45-50⁰С СПА добавьте, соблюдая стерильность 5 мл крови, перемешайте и разлейте в стерильные и предварительно подогретые чашки Петри.

Задание 3

1. Возьмите сыворотку крови обследуемого и бруцеллезный диагностикум и поставьте реакцию Хеддльсона, учтите результат и сделайте заключение.

Алгоритм

постановки реакции Хеддльсона

1. Стекло, на котором производится реакция, расчерчивается на квадраты величиной примерно 4х4см каждый, по горизонтали должно быть 6 квадратов.

2. На первом квадрате стекла записывается номер испытуемой сыворотки, в следующие квадраты разливают (микропипеткой или градуированной пипеткой 1мл) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04; 0,02; 0,01; 0,02 (кс).

3. К первым трем дозам сыворотки добавляют пипеткой 0,03мл неразведенного диагностикума.

4. К последней дозе 0,02мл сыворотки добавляют 0,03мл 0,09% раствора хлористого натрия.

5. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном стеклянной палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки.

6. Контроль антигена ставят с добавлением 0,03мл 0,9% раствора хлористого натрия к 0,03мл антигена.

7. Затем стекло равномерно подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило нагревание всей поверхности стекла примерно до 37⁰С±0,5⁰ (около 2 мин).

8. В случае положительной реакции в первые же минуты появляются ясные хлопья. Максимальный срок наблюдения 8 мин.

9. Учет реакции производят невооруженным глазом. Реакция оценивается как положительная при агглютинации не менее, чем на два плюса (++): незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50% агглютинации.

Для диагностической оценки результатов рекомендуется следующая схема:

а) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки – реакция «отрицательная»;

б) агглютинация в первой дозе – (0,04мл сыворотки) – результат «сомнительный»;

в) агглютинация во второй или в третьей дозах (0,02-0,01мл сыворотки) – результат «положительный»;

г) агглютинация на 4 плюса во всех дозах сыворотки – результат «резко положительный».

Примечание. Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. РА должны обязательно ставить одновременно с постановкой аллергической пробы. При наличии сомнительного результат рекомендуется повторная постановка реакции через 7-10 дней. Так как реакция Хеддльсона является только качественной реакцией, то рекомендуется использовать ее только в условиях массового обследования.

Схема

постановки реакции Хеддльсона

Результат: «Реакция Хеддльсона ….

Заключение:

Задание 4.

Возьмите сыворотку крови обследуемого и бруцеллезный диагностикум и поставьте реакцию Райта, учтите результат и сделайте заключение.

Алгоритм и правила

постановки реакции Райта.

1.Реакцию ставят методом равных «объемов» в тщательно вымытых сухих пробирках в объеме 1мл.

2.Кровь для исследования берут с соблюдением правил асептики из пальца. Исследуемая сыворотка должна быть совершенно прозрачной (без примеси эритроцитов) и применяется не позднее 3-4 дней после взятия крови;

3.Реакцию ставят не менее, чем в 5 разведениях сыворотки (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800), так как она иногда может быть отрицательной в низких и положительной в высоких разведениях – явление, наблюдавшееся иногда в сыворотках с высоким титром, так называемые «проагглютинационные» зоны.

4.Для реакции Райта употребляют исходную взвесь диагностикума, разведенную в 10 раз. Перед употреблением диагностикум тщательно встряхивают.

5.Сыворотки и диагностикум для РА разводят 0,9% раствором хлористого натрия, содержащим 0,5% фенола.

6. В пробирки разливают по 0,5мл сыворотки в разведениях 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и 1:25 (для контроля сыворотки).

7.Во все пробирки, кроме последней, добавляют по 0,5мл разведенного в 10 раз диагностикума, в последнюю пробирку такое же количество карболизированного 0,9% раствора хлористого натрия.

8.Таким образом, получают ряд разведений сыворотки 1:50,1:100,1:200,1:400, 1:800 и 1:50.

Пробы агглютинации ставят на 24 часа в термостат при температуре 37⁰С±0,5⁰, после чего производят учет результатов реакции путем сравнения с контролями диагностикума.

9. Контрольные разведения диагностикума готовят следующим образом: в 4 пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл разведенного диагностикума, затем в том же порядке добавляют 3мл, 2 мл и 1 мл 0,9% раствора хлористого натрия, содержащего 0,5% фенола; в последнюю пробирку ничего не добавляют. После взбалтывания содержимого переносят в другой ряд пробирок по 0,5мл антигена каждой концентрации и 0,5мл карбо-лизированного 0,9% раствора хлористого натрия. Таким образом получают 4 пробирки (контрольные разведения с различной степенью просветления) 75% - 3+, 50% - 2+, 25% - 1+ и О, которые вместе с опытными пробирками помещают в термостат при температуре 37⁰С ± 0,5⁰ на 18 - 24 часа.

10.Учет РА производят через 24 часа путем сравнения степени просветления в опытных пробирках с соответствующими разведениями контрольного диагностикума.

Учет результатов производят на темном фоне. Титр РА выражают в Международных единицах антител (МЕ).

При диагностической оценке результатов реакции рекомендуется следующая схема: при содержании в испытуемых сыворотках менее 100 МЕ антител (титр 1:50) результат «сомнительный», при содержании 100-200 МЕ антител (титр 1:100-1:200) результат «положительный», при содержании свыше 200МЕ (титр – 1:400 и выше) – результат «резко положительный».

Схема

постановки реакции Райта

Заключение:

Задание 5.

1. Приготовьте эмульсию почвы

Способ приготовления: к 1г почвы добавьте 10мл стерильной водопроводной воды. Закройте пробирку резиновой пробкой и проведите предварительную обработку почвы путем 10-минутного вертикального встряхивания почвенной суспензии с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агрегатов.

2. Через 30 секунд, чтобы осели грубые минеральные частицы, сделайте посевы эмульсии почвы:

- на чашки Петри с СПА (шпателем);

- на чашки Петри с 5% кровяным агаром (петлей на 1 сектор, чашку разделить на 4 сектора);

- в пробирку с СПБ.

Все посевы поставьте в термостат при 37⁰С на 24 часа.

Задание 6.

Проведите II-ой этап бактериологического исследования почвы с целью выделения почвенных бацилл по алгоритму:

1. Изучите и запишите в дневник характер роста микроорганизмов, выделенных из почвы, на СПА, 5% кровяном агаре и СПБ.

СПА –

5% кровяной агар –

СПБ –

2. Отберите на чашке Петри с спа (или кровяным агаром) изолированную типичную для бацилл колонию и проведите ее микроскопическое исследование, зарисуйте мазок в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

3. Оставшуюся часть изученной колонии пересейте на скошенный СПА для выделения и накопления чистой культуры → 37⁰С на 24 часа.

Задание 7.

Изучите по таблице дифференциальные признаки B.anthracis, антракоидов и почвенных бацилл.

Дифференциальные признаки

B. anthracis, антракоидов и почвенных бацилл.

Условные обозначения: + наличие капсулы; - отсутствие подвижности, капсулы.

Задание 8.

I проведите III-ий этап бактериологического исследования почвы с целью выделения почвенных бацилл по алгоритму:

1. Проверяют однородность чистой культуры в мазке по Граму, зарисуйте мазок в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

2. Проверяют капсулообразование в мазке по Бурри-Гинсу; зарисуйте мазок в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

3. Проверяют спорообразование в мазке по Пешкову (или по Ожешко); зарисуйте мазок в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

4. Проверяют подвижность культуры в препарате «висячая капля»; зарисуйте препарат в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

5. Проверяют гемолитическую активность, делая посев на 5% кровяном агаре → 37⁰С на 24 часа.

Результат:

Заключение:

6. Тест «жемчужного ожерелья»: делают посев на чашку СПА с пенициллином (0,5 - 0, 05ЕД/мл) → 37⁰С на 24 часа. Из колонии делаю мазок по Граму: выявляют грам+ бациллы в виде шаров, расположенных цепочкой.

Сделайте мазок из культуры, выделенной на СПА с пенициллином, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

Проводят постановку других тестов идентификации B. antracis:

7. Фаголизабильность чистой культуры специфическим сибиреязвенным фагом.

8. Вирулентность проверяют, заражая п/к кролика; через 2-3 суток он погибает от септицемии, отмечается отсутствие трупного окоченения, несвернувшаяся густая темная кровь, в мазках – капсульные грам+ палочки.

9. С чистой культурой ставят РИФ.

10. Проба на чувствительность к антибиотикам.

II По результатам всех поставленных тестов сделайте заключение, т. е. выдайте окончательный ответ.

Заключение: «Выделены

Задание 9

I Изучите алгоритм постановки реакции термопреципитации по Асколи с целью выявления сибиреязвенного Аг в трупах павших животных, некротической ткани карбункулов, кожевенном сырье и готовой продукции.

Алгоритм

постановки реакции термопреципитации по Асколи

1. Для получения термоэкстракта исследуемый материал (кусочки органов – селезенки, геморрагий, воспаления, шерсти, шкур и т.п.) измельчают, заливают 25-50-кратным объемом ИХН, кипятят 5-10 мин, фильтруют до полной прозрачности через прокаленную асбестовую вату или фильтровальную бумагу, смоченную ИХН. Прозрачный фильтрат используют как Аг.

2. В преципитационную пробирку пастеровской пипеткой вносят 0,2-0,3мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки (на дно, не касаясь стенок пробирки).

3. Затем другой пастеровской пипеткой по стенке наклоненной пробирки осторожно наслаивают такое же количество испытуемого термоэкстракта.

4. К опыту ставят контроли:

1) преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + стандартный сибиреязвенный Аг;

2) преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + термоэкстракт из органов здорового животного;

3) преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия;

4) нормальная сыворотка + термоэкстракт исследуемого материала.

5. Учет результатов реакции проводится невооруженным глазом при комнатной температуре.

Первый контроль – заведомо положительный, остальные – заведомо отрицательные.

В положительном случае в опытной пробирке через 1-15 мин на границе соприкосновения сыворотки и экстракта появляется кольцо молочно-белого цвета.

II Заполните схему постановки реакции термопреципитации по Асколи.

III Поставьте реакцию термопреципитации по Асколи (опыт), учтите результат и сделайте заключение.

Результат:

Заключение:

Задание 10.

Изучите диагностические препараты, используемые для диагностики бруцеллеза и сибирской язвы - демонстрация препаратов, запишите их название в дневник и укажите, с какой целью они используются:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Оценка: _______________

Подпись преподавателя: ________________