Занятие Тема: « Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника».

Тема: « Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника».

I План занятия

1. Изучить правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала при подозрении на дисбактериоз кишечника.

2. Научиться проводить подготовку биологического материала и всех ингредиентов для микробиологического исследования.

3. Освоить методику комплексного исследования на дисбактериоз кишечника.

IIСамостоятельная работа

Задание 1

Изучите определение понятия «дисбактериоз», его виды и показания к обследованию на дисбактериоз кишечника.

Термин «дисбактериоз» был введен в микробиологическую практику Nissle в 1916 году.

А.П. Красильников дает следующее определение этого понятия:

«Дисбактериоз» - состояние микробиоценоза того или иного биотопа организма человека и животных, характеризующееся относительно стабильным и длительным количественным и качественным изменением состава его видов и вариантов, выходящим за пределы физиологической нормы».

«Дисбактериоз» - это нарушения микробиоценоза различных биотопов человеческого организма, выражающиеся в изменении инфраструктурного отношения анаэробы/аэробы, популяционной численности и состава микробных видов биотопов, их метаболической активности (О.Н. Минушкин, М.Д. Ардатская и др., 1999г)

В основе развития дисбактериоза лежит изменение условий обитания в биотопе, в результате которого популяции одного или нескольких видов аутофлоры или видов, занесенных из других биотопов хозяина или внешней среды , получают преимущества для роста и размножения перед своими конкурентами и приобретают несвойственное им доминирующее положение в микробиоценозе.

Новые количественные и качественные соотношения только тогда станут дисбактериозом, когда нарушатся механизмы аутостабилизации, присущее всем исторически сложившимся микробиоциноза.

К факторам развития дисбактериоза можно отнести:

Ø стресс

Ø неадекватное питание

Ø различные сопутствующие заболевания (инфекционные и неинфекционные)

Ø приобретенные или наследственные нарушения иммунной регуляции

Ø медикаментозное вмешательство (облучение, прием гормонов, иммунодепрессантов, протезирование)

Ø влияние ряда химических соединений, используемых в качестве добавок к лекарственным препаратам и пищевым продуктам

Ø влияние на организм различных промутагенов, мутагенов, канцерогенов

Ø длительное нахождение человека в небольших замкнутых коллективах, экстремальных условиях (в подводных лодках, космических аппаратах и др.)

Ø работа на предприятиях с профессиональными вредностями (например, в микробиологической промышленности).

Важные условия развития и выраженности дисбактериоза – влияние комплекса причинных факторов, их высокая повреждающая микрофлору или (и) хозяина сила и длительность действия.

Дисбактериоз обычно развивается постепенно. Начальную стадию его трудно отдифференцировать от физиологического состояния, позднюю стадию – от заболевания.

Классификация дисбактериоза:

Дисбактериоз различают в зависимости от:

А) локализации: полости рта, глотки, носа, тонкий и толстый кишечник, вагина, кожа;

Б) этиологии: грибковый, главным образом кандидозный, протеусный, псевдомлнадный, стафилококковый, энтеробактериальный и др.

Следует также рассматривать дисбактериоз как самостоятельное состояние и как осложнение заболевания органа иной этиологии.

Дибактериоз кишечника – это нарушение качественного состава и популяционного уровня симбиотической микрофлоры кишечника, возникающее под воздействием различных причин и имеющее клинические проявления болезни.

Задание 2

Приготовьте питательные среды:

1. Среду Симмонса по прописи на этикетке в объеме 50 мл, разлейте в бактериальные пробирки и скосите, пользуясь ШСА.

2. Среды Эндо, Левина, Плоскирева по прописи на этикетках в объеме 100 мл и разлейте в чашки Петри.

3. Селенитовый бульон по прописи на этикетке в объеме 100 мл.

4. Скошенный СПА и 5% кровяной агар, для чего расплавьте стерильный СПА во флаконах (2) на водяной бане, охладите до 45-50⁰ С, разлейте в бактериальные пробирки и скосите, пользуясь ШСА; во 2-ой флакон добавьте 5% дефибринированной крови и разлейте в чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

5. ЖСА: расплавьте стерильный солевой агар на водяной бане, охладите до 45-50⁰С, добавьте 20% стерильной желточной взвеси, разлейте в чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

6. Тиогликолевую среду по прописи на этикетке в объеме 100 мл и разлейте в пробирки по 10 мл.

7. Среду Сабуро по прописи на этикетке в объеме 100 мл; разлейте в чашки Петри.

8. 1% сахарный агар, добавив 1 г глюкозы к 100 мл расплавленного и охлажденного до 45-50⁰С СПА; разлейте в чашки Петри.

9. Среду Вильсон-Блера по прописи на этикетке в объеме 100 мл, охладите до 45-50⁰С и разлейте в 1 чашку Петри и в 3 пробирки, предварительно внеся в последние по 1 мл исследуемого материала, высоким столбиком (по 9 мл среды).

10.Желчно-щелочной агар (ЖЩА) в объеме 100 мл и разлейте в чашки Петри.

Способ приготовления: готовят 3% СПА по прописи на этикетке ифильтруют. К 60% этого агара прибавляют 40% нативной профильтрованной желчи. Разливают во флаконы и стерилизуют при 1 атм. 30 мин.

Задание 3

1.Изучите правила забора и транспортировки исследуемого материала при подозрении на дисбактериоз кишечника.

Для определения качественного и количественного содержания микрофлоры кишечника производится бактериологическое исследование. Материалом исследования служат испражнения. Для забора материала больному дают стерильную, предварительно взвешенную бутылочку, куда собирают фекалии (в пределах грамма) и после повторного взвешивания определяют истинное количество пробы. Проба должна быть доставлена в лабораторию не позднее 2-х часов с момента забора (в исключительных случаях допускается более поздняя доставка при условии охлаждения пробы при температуре 2-4 ºС)

2.Проведите подготовку биологического материала (фекалий) для исследования на дисбактериоз.

Алгоритм

приготовления разведений фекалий для исследования на дисбактериоз.

1. Посуду с испражнениями взвешивают для определения веса кала. Например: посуда весит 14г 50 мг, взвешивают посуду с испражнениями и получают, например, 14 г 770 мг, то, следовательно, вес кала будет 14, 770 – 14, 050= 0, 720 г.

2.После определения количества фекалий в эту же посуду добавляют 9-ти кратное к весу фекалий количество растворителя (0, 85% раствора хлорида натрия или фосфатно-буферного раствора), т.е. соотношение материала и растворителя должно быть 1:10. Значит необходимо добавить растворителя в количестве : 0,720 * 9=6, 48 мл, можно округлить до 6,5 мл. Получаем исходное разведение 10ֿ¹ (1:10). (Можно также в пробирку с 9 мл физ раствора добавить 1г фекалий, но в случае, если фекалий мало, то можно к 4,5 мл раствора добавить 0,5 г кала).

3.После тщательно эмульгируют материал с помощью стеклянной палочки, дают осесть нерастворившемся частицам в течение 5 мин. и из основного разведения делают ряд последующих (1:100; 1:1000; 1:10000 и т.д. до разведения 10^-8 - 10ˉ¹º).

Внимание!Каждое разведение кала готовят стерильной пипеткой.

Задание 4.

Проведите посевы из соответствующих разведений исследуемого материала на приготовленные питательные среды, пользуясь схемой микробиологического исследования на дисбактериоз, и поместите их в термостат согласно указанных режимов инкубации.

Схема микробиологического исследования на дисбактериоз

(первичные посевы)

Задание 5

Изучите схему проведения комплексного исследования на дисбактериоз кишечника.

Схема проведения анализа по дням исследования:

1 день: Приготовление разведений фекалий и засев материала на плотные элективные и дифференциальные питательные среды (Плоскирева, ЖСА, Эндо кровяной, желчно-кровяной, Сабуро, скошенный СПА по Шукевичу), на среды Вильсона-Блера (2-е пробы: гретая и не гретая), Блаурокка, молоко. Параллельно с прямым посевом испражнений делают посев на среды обогащения. Мы рекомендуем для накопления сальмонелл магниевую среду. Производится подготовка чашки с глюкозной средой для определения антагонистической активности исследуемой флоры.

2день: Просмотр чашек Петри, изучение выросших колоний, пересев подозрительных колоний на среды Эндо, Плоскирева на среду Клиглера; характеристика роста на скошенном СПА по Шукевичу (наличие или отсутствие ползучего роста), высев со среды накопления на плотные питательные среды (висмут-сульфитная среда); снятие подозрительных колоний с желчно-кровяного агара , с Эндо с кровью на кровяной агар; просмотр пробирок со средой Вильсона-Блера, пересев подозрительных колоний.

3 день: Просмотр чашек со средами: ЖСА (микроскопия, постановка тестов: плазма, маннит и др.), Сабуро (микроскопия; дальнейшая идентификация), кровяной агар (микроскопия, дальнейшая идентификация, биохимический ряд для идентификации энтерококков: молоко с синькой, маннит, ЭДДС, EF-агар), просмотр чашек на анаэробы, учет результатов роста на скошенной среде Клиглера (мазки, агглютинация), постановка пестрых рядов.

4 день: Учет результатов биохимических тестов на стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, анаэробы. Определение вида кандид. Постановка чувствительности к антибиотикам выделенных культур. Просмотр чашек с висмут-сульфитной средой, снятие подозрительных колоний на среду Клиглера. Посев на чашку с глюкозной средой музейных патогенных культур (S. typhimurium, Sh. sonnei, St. aureus и др.) для определения антагонистической активности исследуемой микрофлоры.

5 день: Просмотр пробирок со средой Блаурокка (микроскопия), Титрование молока и количественный учет молочнокислых палочек; учет чувствительности к антибиотикам выделенных культур; отбор подозрительных культур со среды Клиглера, агглютинация, постановка пестрых рядов, чувствительности к антибиотикам выделенных культур; просмотр среды Вильсона-Блера, при почернении со среды с гретой культурой- постановка пестрого ряда (молоко с синькой, глюкоза, лактоза, маннит, сахароза, дульцит, мальтоза, МПАкр., ЖСА). Учет антагонистической активности.

6 день: Идентификация выделенных культур, высеянных со среды накопления, учет чувствительности к антибиотикам выделенных культур. Идентификация клостридий по классическим методикам. Выдача окончательного ответа.

ВНИМАНИЕ! Все штаммы, подозрительных по культуральным и биохимическим признакам в отношении принадлежности к патогенным энтеробактериям, должны быть идентифицированы серологически.

Задание 6

Изучите схему идентификации культур при обследовании на дисбактериоз кишечника.

Схема микробиологического исследования на дисбактериоз

(идентификация культур)

1. Идентификация патогенных энтеробактерий, кишечной палочки, бактерий родов Протеус, Клебсиелла, Стафилококки, энтерококков, псевдомонад проводится по общепринятым схемам.

2. Идентификация грибов Candidaпроводится по культуральным свойствам колоний грибов рода Candida выпуклые, сметанообразные, глянцевитые (но не мокрые), гладкие или морщинистые, сначала белые, затем кремовые и через 1-1,5 месяца коричневатые; со временем колония врастает в среду. Микроскопически обнаруживают нити мицелия и большое количество почкующихся круглых или овальных клеток. Этих морфологических данных достаточно для определения грибов рода Candida. Определение вида для практических целей не обязательно (более 80% случаев определяется C. аlbicans).

3. Идентификация бифидобактерий:

Из посевов разведений фекалий, в которых виден рост в виде помутнения всей среды, в виде отдельных колоний или тяжей, готовят окрашенные по Граму мазки. Под микроскопом бифидобактерии имеют разветвления на концах палочек, могут быть в виде римской цифры 5 или гантелей с колбовидными утолщениями на концах, часто скопления их имеют вид китайских иероглифов, гр⁺ (редко встречаются гр^-). Выделение чистой культуры B.bifidum является трудоемким и практически необязательным, т.к. определение разведения, в котором обнаруживаютB.bifidum, является вполне достаточным для оценки нормального или пониженного их содержания в фекалиях.

4.Идентификация лактобацилл

Через 3 суток инкубации посевов проводят микроскопическое исследование. Молочнокислые бактерии имеют форму прямых или изогнутых палочек, коккобацилл, располагаются одиночно или цепочками, аспорогенные ( за редким исключением) гр⁺, неподвижны.

5. Идентификация спороносных анаэробных клостридий проводится по характеру роста на среде Вильсона-Блера. Анаэробные бактерии образуют на ней черные колонии. При наличииCl.Perfringensсреда изменяется уже через 1-2 часа. Другие виды анаэробов образуют зеленовато-черные колонии через 6-18 часов

6.Учет ингибирующей активности к патогенным микроорганизмам:

Задание 7

Изучите правила учета и оценки результатов микробиологического исследования на дисбактериоз кишечника.

Оценка результатов.

Диагноз дисбактериоза выставляется на основании данных бактериологических исследований (2-х и 3-х кратных), при наличии стойких отклонений от нормы, по качественным и количественным показателям и их сочетанием, например, - при отсутствии роста: - бифидобактерий в 10^-6 - 10^-8 разведении; молочнокислых бактерий в 10^-2разведении; - снижении количества типичной кишечной палочки до 10⁴и менее в 1 г. фекалий; при увеличении количества лактозонегативных штаммрв кишечных палочек более 10%-20%, при выделении из фекалий гемолизирующей кишечной палочки в любом количестве, а также выделения St. аureus; - при выделении из фекалий условно-патогенных микроорганизмов(протей, кандида)более 10⁵ у детей и более 10⁴ у взрослых; при увеличении количества штаммов Str.faecium, когда соотношение Str.faecalis/Str.faecium <3.

Для более точного установления диагноза дисбактериоза рекомендуется проводить серологическое исследование: реакцию агглютинации с аутоштаммами.

Для оценки степени выраженности дисбактериоза необходимо учитывать количественные и качественные изменения микрофлоры кишечника, которые позволяют дифференцировать их на три группы: 1- выраженные дисбактериозы, 2- умеренные дисбактериозы, 3- слабо выраженный или легкий. Первая группа включает сочетанные нарушения аэробной и анаэробной флоры: снижение количества бифидо- или лактобактерий при повышении или понижении количества кишечной палочки, увеличение других условно-патогенных бактерий и снижение антагонистической активности нормальной микрофлоры;2- нарушение только в аэробной части микробиоценоза, т.е. изменения содержания кишечной палочки, выходящее за пределы нормы взрослого человека, снижение антагонистической активности кишечной микрофлоры в сочетании с увеличением выше нормы титра условно-патогенных бактерий; 3- состояние микрофлоры кишечника, когда за пределы нормы выходит лишь один показатель (количество кишечной палочки или титр условно-патогенных бактерий одного вида).

Формулировка ответа при дисбактериозе может быть:

1) «Кишечная микрофлора в норме» - при отсутствии каких-либо качественных и количественных изменений.

2) «дисбактериоз выявлен» и далее указывают на основании каких признаков выставлен диагноз.

3) Например, дисбактериоз выявлен и характеризуется:- увеличением количества (50%) лактозонегативных кишечных палочек, появлением гемолизирующих кишечных палочек; ассоциированным увеличением количества условно-патогенных микроорганизмов (протей-10⁵, кандида-10⁵) и т.д.

Оценка___________

Подпись преподавателя ______________

Результаты микробиологического исследования на дисбактериоз № _________

Ф.И.О._______________________________________________________________________

Возраст______________________________________________________________________

Дом. адрес____________________________________________________________________

Диагноз______________________________________________________________________

Чувствительность к антибиотикам:________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

«___»____________________20 __г