Тема: «Методы диагностики вирусных инфекций».

I План занятия.

1.Закрепить знания по изучению классификации вирусов, строения вирусных частиц и методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.

2.Изучить методы индикации вирусов в инфекционном материале.

3.Познакомиться с правилами забора исследуемого материала для вирусоскопических и вирусологических методов исследования.

4.Изучить методику заражения и вскрытия куриных эмбрионов и закрепить методы выделения вирусов в организме животных.

5.Изучить принципы РГА и РТГА и методику постановки РТГА при вирусных инфекциях.

6. Закрепить знания по изучению механизмов и методик постановки серологических реакций:

ИФА, иммуноблотинг, применяемых для диагностики вирусных инфекций.

7.Изучить принцип и методику постановки полимеразной цепной реакции для диагностики

вирусных инфекций.

8.Изучить виды тест-систем используемых для постановки ИФА и ПЦР при вирусных

инфекциях.

9.Экскурсия в вирусологическую лабораторию (по возможности).

II Самостоятельная работа.

Задание 1.

Изучите методы диагностики вирусных инфекций и методы индикации вирусов в инфекционном материале:

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций человека и животных основаны:

▪на прямых микроскопических методах обнаружения вирионовв патологическом материале.

▪серотипаже (идентификации) чистых культур вирусов выделенных из материала.

▪серодиагностике, т.е. косвенном способе определения вирусспецифических антител в сыворотке крови.

Методы индикации вирусов в инфекционном материале. Микроскопические: а) вирусоскопия; б) обнаружение внутриклеточных включений; в) метод иммунофлюоресценции.

Биологические, включающие выделение вирусов: а) в культурах клеток; б) в развивающихся куриных эмбрионах; в) на лабораторных животных.

Методы гемагглютинации и гемадсорбции: а) реакция гемагглютинации; б) реакция гемадсорбции.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических методов, включающих: а) РТГА; б) РН; в) реакцию задержки гемадсорбции и нейтрализации с учетом результатов по гемадсорбции; г) РСК; д) РП в геле; е) РИФ; ж) ИФА.

Задание 2.

Изучите правила забора исследования материла для вирусоскопических и вирусологических методов исследования.

Материалами в которых содержатся вирусы могут являться: кал, моча, мокрота, носоглоточные смывы, содержимое высыпаний на коже и слизистых оболочках и прочие экскреты; кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты плевральной и брюшной полости, суставов, увеличенных лимфатических узлов и другие секреты.

От умерших людей и погибших животных берут пораженные вирусами органы и ткани.

Взятые для исследования материалы при необходимости подвергаются специальной обработке для приготовления мазков и гистологических препаратов, а при инфицировании культур клеток, эмбрионов и животных – материал измельчается, отстаивается, фильтруется, осветляется, концентрируется и обрабатывается антибиотиками, которые уничтожают постороннюю микрофлору.

Задание 3.

1.Проведите риноцитоскопическое исследование мазков-отпечатков для обнаружения вирусных включений, зарисуйте мазок в дневник и сделайте заключение.

Алгоритм проведения риноцитоскопии при гриппе и других острых респираторных заболеваниях.

1. Забор материала для исследования проводят с помощью тонкого ватного тампона, увлажненного ИХН. Тампон вводят в носовой ход (взрослому на 2 см, ребенку в зависимости от возраста – на1-1,5 см), слегка прижимая его всеми сторонами к слизистой оболочке нижней носовой раковины.

2. Затем делают мазки-отпечатки на чистом, обезжиренном предметном стекле.

3. Отпечатки, высушенные на воздухе, без фиксации опускают на 1-2 мин. в раствор неразведенного красителя Романовского.

4. Затем их промывают дистиллированной водой, высушивают с иммерсионной системой.

Примечание.

Чаще всего применяют окраску по Романовскому, Пигаревскому или Павловскому.

5. Учет результатов.

В окрашенных отпечатках слизистой оболочки носовых раковин здоровых людей обнаруживаются комочки слизи, пласты многослойного плоского эпителия, небольшое количество полиморфных лейкоцитов и отдельные клетки неизмененного цилиндрического эпителия. Цитоплазма клеток окрашивается в розовато-синий цвет, ядра – в синий, ядрышки в насыщенно синий.

При гриппе в препаратах – отпечатках слизистой оболочки носа обнаруживают группы клеток и пласт измененного цилиндрического этителия. Клетки эпителия увеличенные, округлые, лишены ресничек имеют пикнотическое или лизированное ядро и вакуоли в цитоплазме. В клетках цилиндрического эпителия обнаруживают четко контурированные включения диаметром от 0,5 до 5 мкм, располагающиеся в цитоплазме, вблизи ядра по одному и более в клетке. По Романовскому включения красятся в фиолетовый цвет, по Пигаревскому и Павловскому – в ярко-красный. Такие же включения обнаруживают в цитоплазме дегенерированных макрофагов, лейкоцитов и клеток плоского этителия.

Мазок - отпечаток со слизистой оболочки носовой полости (окр. по Романовскому)

Заключение:

2. Изучите по таблицам специфические тельца и включения, образуемые вирусами при бешенстве и натуральной оспе, зарисуйте в дневник и подпишите.

Тельца Пашена Включения Включения

(серебрение по Гварниери Бабеша-Негри

Морозову) (окр. по Романовскому-Гимзе) (окр. по Романовскому-Гимзе)

Задание 4.

1. Изучите способы заражения куриных эмбрионов с целью выделения вирусов из патологического материала.

Клетки внешних зародышевых оболочек и ткани, органы и желточный мешок развивающегося куриного эмбриона составляют среду, необходимую для размножения большинства вирусов и риккетсий, патогенных для человека.

Эмбрионы моложе 10-11 дней часто погибают от инфекции вследствие быстрого размножения инфекционных агентов, эмбрионы старшего возраста более удобны для изучения инфекционных процессов. В зависимости от способа заражения пользуются эмбрионами неодинаковых сроков инкубации: 5-8-дневными – при заражении в желточный мешок, 7-9-дневными – в амнион, 9-12-дневными – на хорионаллнтоисную оболочку, 10-11-дневными – в аллантоисную полость, как это показано в таблице.

Возраст эмбриона определяется особенностями данного вируса, а также и тем, какой орган избирается для инокуляции.

Просвечивание инкубированных яиц помогает отличить неоплодотворенные яйца и мертвые эмбрионы от живых. Яйца просвечивают с помощью овоскопа в темной комнате; эмбрион имеет вид темного диска, а неоплодотворенные яйца прозрачны. В инкубированных яйцах наблюдаются движения эмбриона и кровеносные сосуды хорионаллнтоисной оболочки.

Материал для заражения должен быть бактериологически стерильным. Сапрофиты, некоторые патогенные бактерии, плесневые грибы, случайно попадающие во время заражения, быстро растут и часто убивают вводимый вирус. С целью подавления бактериального загрязнения материала, используемого для вызывания вирусной инфекции эмбриона, к нему добавляют соответствующим образом составленные смеси пенициллина и стрептомицина.

Методы заражения.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Для нанесения вирусного материала, на хорионаллнтоисную оболочку ее обнажают путем удаления небольшого участка скорлупы и разрыва скорлуповой оболочки. Необходимое для операции место определяется при просвечивании яйца и вносится исследуемый материал. Вскрытый участок скорлупы после заражения может быть закрыт разными способами, например, его закрывают покровным стеклом или кусочком целлофана, края которых заливаются парафином.

После заражения эмбрионы инкубируются при температуре 36-37,5⁰С и в них происходит размножение вируса.

В зараженном эмбрионе вирусные поражения в оболочке достигают высокого развития через 48-96 часов. При постороннем инфицировании смерть эмбриона наступает также в течение этого периода.

Заражение в аллантоисную полость. Применяется для культивирования вируса гриппа, вирусов таежного и весеннего энцефалитов. Обычно используют эмбрионы 10-11 дневной инкубации, так как к этому сроку собирается больше всего аллантоисной жидкости. Инфекционный материал вводят шприцом с иглой, прокалывающей подскорлупную оболочку в хорионаллантоис на несколько мм. Жидкость собирают через 3648 часов после инкубации. Аллантоисные культуры вируса сохраняются без консервации при температуре не выше 4⁰С; в случае необходимости более длительного хранения жидкость замораживают.

В аллантоисной жидкости не отмечается специфических изменений, указывающих на присутствие инфекционных агентов(иногда наблюдается помутнение жидкости).

Заражение в желточный мешок. Используют эмбрионы 5-9 дневной инкубации. Для размножения вирусов японского и шотландского энцефалитов и возбудителей реккитсеозов. При заражении применяют метод «окна». Желток хорошо виден через овоскоп, а место инъекции определяют визуально; заражение осуществляют шприцом с иглой.

Заражение в амниотическую полость. Амнион к 5 дню инкубации обволакивает весь эмбрион, который полностью погружен а амнитическую жидкость, наполняющую амниотический мешок. Для заражения используют эмбрионы 6-12 дневной инкубации. Выбор зависит от изучаемого вируса, например, для вируса гриппа нужны 10 дневные эмбрионы, для вируса паратита 6- дневные эмбрионы.

Эмбрион просвечивают в овоскопе и на скорлупе отмечают участок где наиболее хорошо видны движения эмбрионов. Вскрытие производят по методу «окна», который позволяет хорошо видеть ход иглы и место инъекции. Иглу вводят в амниотическую полость через хорионаллантоис, как можно ближе к краю желточного мешка.

Задание 5.

1. Изучите принципы культивирования вирусов методом заражения культур клеток.

Культура клеток – клетка какой-либо ткани животных, выращенные в искусственных условиях на стеклянной или пластмассовой поверхности, залитой специальной питательной средой.

Источником клеток могут быть свежие ткани, например плода, куриного эмбриона или перевиваемая линия клеток. Источник клеток обычно измельчают в гомогенизаторе, обрабатывают раствором трипсина, для разрушения межклеточного вещества, освобождают от детрита, взвешивают в питательной среде и помещают во флаконы, где клетки оседают на стенки, размножаются и образуют монослой.

Клеточные культуры.

Превичные культуры Стабильные линии Клеточные

клеток клеток штаммы

1. Культура клеток 1. Неlа 1. Диплоидные

2. обезьян 2. КВ клетки

3. Культура клеток 3. Нер. -2

фибробластов 4.Дейтройт - 6

эмбриона человека 5.СОЦ

4. Культура клеток 6. ПМС и др.

фибробластов кури-

ного эмбриона и др.

2.Изучите виды питательных сред для клеточных культур – демонстрация сред.

Классификация питательных сред для клеточных культур.

Сбалансированные солевые растворы; р-р Эрла, р-р Хенкса; р-р Дульбекко и Фогта.

Поддерживающие среды: среда 199, среда Игла, 0,5% гидролизат лактальбумина, гемодролизат.

Ростовые среды

1. Естественная(среда Эндерса).

2. Ферментативные гидролизаты (аминопептид, гемогидролизат, гидролизат лактальбумина).

3. Синтетические(среда Игла, среда 199)

Примечание: К указанным средам добавляют 10% сыворотки крупного рогатого скота.

Задание 6.

1. Изучите по таблицам ЦПД вирусов в культуре клеток, зарисуйте в дневник и подпишите.

2.Изучите вид «цветной» пробы – демонстрация пробирок, зарисуйте в дневник и подпишите.

3. Изучите эффект бляшкообразования (стерильные пятна), который вызывают цитопатогенные вирусы в культурах клеток – демонстрация флаконов с вирусными бляшками. Зарисуйте в дневник и подпишите.

Примечание: Вирусная бляшка – это участок клеточного монослоя, пораженный потомством одной вирусной частицы.

Задание 7.

Серотипаж – идентификация чистых культур вирусов выделенных из патологического материала.

Серодиагностика – определение вируспецифических антител в сыворотке крови.

▪В серотипаже вирусов используют многие серологические реакции: РСК, РНГА, РТГА, РН, РИФ, ИФА.

▪При серодиагностике необходимо помнить, что антитела по отношению к вирусам вырабатываются медленно, поэтому исследуется динамика нарастания титра антител, для чего серологические реакции ставят с сыворотками, одна из которых берется от больного в разгаре вирусной инфекции(5-7 сутки от начала заболевания), а другая через 2-3-4 недели, когда титр антител у детей закономерно удваивается, а у взрослых достигает 4-х кратного увеличения.

▪Серодиагностика осуществляется с помощью тех же реакций, которые применяются для серотипажа вирусов. В качестве антигена используются производственные вирусные диагностикумы, взвесь вирусных культур и даже сыворотки выздоравливающих больных, содержащие вирусные антигены.

1. Изучите принципы реакции гемагглютинации (РГА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Гемагглютинация– склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием различных агентов. Эритроциты одних лиц могут агглютинироваться сыворотками других вследствие наличия в последних нормальных изогемагглютининов. При помощи реакции изогемагглютинации устанавливается принадлежность человека к определенной группе крови.

Феномен гемагглютинации используется также при микробиологических и иммунологических исследованиях.

Различают два вида гемагглютинации:

1. Прямую, или активную, обусловленную непосредственным воздействием тех или иных агентов на эритроциты;

2. Непрямую, или пассивную, когда эритроциты предварительно сенсибилизированные антигеном, агглютинируются иммунной к этому антигену сывороткой.

Прямая гемагглютинация (РГА) может быть вызвана вирусами, бактериями и другими агентами.

Механизм прямой гемагглютинации сводится к тому, что вирусные гемагглютинины посредством фермента муциназы взаимодействует с расположенными на поверхности эритроцита рецепторами мукопротеидной природы, вызывая адсорбцию вируса на эритроците.

В результате взвесь отмытых куриных эритроцитов образует широкий зернистый осадок из склеившихся эритроцитов, в то время как в отсутствие вируса (контроль.0 эритроциты образуют четко отграниченный ровный диск на дне пробирки.

Механизм РГА – основан на способности гемагглютининов вирусов склеивать эритроциты.

Это свойство используют в РГА для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки РТГА.

Задание 8.

Изучите механизм и схему постановки РТГА с парагриппозными диагностикумами 1, 2, 3 типов.

Механизм РТГА – специфические противовирусные Ат, взаимодействуя с Аг (вирусом), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Или:

РТГА – основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа. кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Высокая специфичность реакции позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов.

При типировании вирусов применяют нативный инфекционный материал, а при типировании антител в сыворотке больного, инфекционный материал, содержащий вирус известного типа или инактивированный гемагглютинирующий диагностикум.

Для ориентировочного типирования выделенных вирусов используют капельный метод на стекле, а для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования Аг в сыворотках реконвалесцентов применяют реакцию в развернутом виде.

Схема постановки РТГА

Примечание:

За титр испытуемой сыворотки принимается наибольшее разведение сыворотки, в котором отмечается полное торможение гемагглютинации.

При постановке парных сывороток достоверной реакцией считается отклонение титра антител в 4 и более раза.

Задание 9.

Изучите принцип (механизм) и методику постановки ИФА и иммуноблотинга.

Принцип ИФА – выявление локализации Аг (Ат) в тканях с помощью Ат (Аг), ковалентно соединенных (обычно глутаральдегидом) с ферментом (чаще – пероксидазой хрена, реже – щелочной или кислой фосфатазой).

ИФА – метод, основанный на обнаружении иммунного комплекса, один из компонентов которого (антитело или антиген) мечен ферментом, способным разлагать субстрат (хромоген) с образованием окрашенных продуктов.

Компоненты:

 иммуносорбент (полистироловый планшет)

 исследуемый материал (сыворотка, слюна, фекальная взвесь, пробы внешней среды)

 коньюгат (пероксидаза, антииммуноглобулиновые антитела)

 хромоген (перекись водорода +ортофенилендиамин; Н2О2+ОФД).

Алгоритмпостановки ИФА для выявления в исследуемой сыворотке крови

специфических антител

1. Реакция протекает на твердом носителе – полистироловом планшете, на дно лунок которого наносится Аг. Планшет может быть сорбирован Аг в заводских условиях или же поставляется в наборе «чистым», в последнем случае нанесение, т.е. сорбцию Аг проводят в лаборатории. Лунку промывают буферным раствором.

2. После сорбции Аг в лунку планшета вносят испытуемую сыворотку (или другой материал), т.е. Ат. При гомологичности Аг и Ат в течение 30 мин образуются иммунные комплексы (Аг+Ат), которые являются невидимыми. Лунку промывают буферным раствором.

3. Внесение в лунку антииммуноглобулиновых антител, меченых ферментом пероксидазой, т.е. коньюгата. Коньюгат взаимодействует с иммунными комплексами (Аг+Ат) и (в течение 30 мин) образуется иммунопероксидазный тройной комплекс (Аг+Ат+ коньюгат), который также остается невидимым. Лунку промывают буферным раствором.

4. Для выявления комплекса (Аг+Ат+ коньюгат) в лунку вносят Н2О2, как хромогенный субстрат для пероксидазы, и ОФД, который соединяется с атомарным кислородом и через 10 минут вызывает изменение цвета лунки (пожелтение) в результате окисления, а это в свою очередь, изменяет оптическую плотность в лунке, которая оценивается с помощью спектрофотометра.

5. Результаты ИФА учитывают при длине волны 492 нм.

Исследуемая сыворотка расценивается как положительнореагирующая, если значение оптической плотности при ее взаимодействии с антигеном (при использовании, например, тест-системы «Рекомбинат-ВИЧ») превосходит не менее, чем в 3 раза, аналогичный показатель в контроле отрицательной сыворотки. При отсутствии спектрофотометра результат учитывают визуально. При визуальном учете реакция считается положительной, если имеются отчетливые различия в интенсивности окрашивания при реакции испытуемой сыворотки по сравнению с контрольной отрицательной сывороткой.

6. При отрицательном результате комплекс (Аг+Ат) не образуется, коньюгат не связывается и после промывки «выходит» из реакции, ОФД его не выявляет, лунка не окрашивается.

Примечание. Этап взаимодействия ОФД с комплексом требует особого внимания и своевременной остановки реакции, что достигается внесением в лунку стоп-реагента (Н₂SO₄).

Схема проведения ИФА

при идентификации антител

Аг+ сыворотка коньюгат +ОФД +H₂SO₄ (стоп-реагент)

Ат Н₂О₂ →Н₂О желтизна остановка реакции

положительная

проба

Иммуноблотинг – тестирование на наличие антител к отдельным вирусным антигенам – является специфическим и применяется для обследования лиц, серопозитивных при обследовании с помошью ИФА.

Принцип иммуноблотинга – это метод, являющийся верификационным и позволяющим дать заключение об истинной позитивности, сомнительном результате или ложной серопозитивности. ИБ также относится к иммунохимическим методам, но, в отличие от ИФА, при постановке реакции выявляют не сумму антител, а спектр антител к белкам ВИЧ.

Принцип метода состоит в том, что в специализированных производственных условиях выращивают ВИЧ in vitro, вирусную массу многократно очищают от примесей и дезинтегрируют вирус. Затем фракционируют вирусные белки в полиакриламидном геле и переносят электрофорезом разделенные белки ВИЧ на нитроцеллюлозную мембрану, которую нарезают на полоски шириной 5 мм, именуемые стрипы. При проведении исследования стрипы с вирусными антигенами помещают в планшет, заливают исследуемой сывороткой, а полученные комплексы Аг-Ат проявляют с помощью иммунохимической реакции, аналогичной иммуноферментному анализу. Учет результатов визуальный: по наличию или отсутствию полос.

В сывортке лиц, инфицированных ВИЧ-К обнаруживают антитела к следующим белка: оболочки (env) – gp160, gp120, gp41; ядра (gag) – p17, p24, p55, а такжее ферментов вируса (pol) – p3 1, p51, pбб. У ВИЧ-2 детектируются антитела к env-gpl40, gpl 05, gp36 ; gag – pi 6, p25, p56; pol – p68.

Результаты, полученные в ИБ, интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные. Согласно рекомендациям ВОЗ положительными считаются сыворотки, в которых обнаружены антитела к двум белкам гена env в сочетании или без реакции с другими белками (gag, pol). При наличии взаимодействия с одним из белков оболочки в сочетании с другими белками реакция считается сомнительной и рекомендуется повторное тестирование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, то рекомендуется исследование в течение 6 месяцев (2 недели, 3 мес, 6 мес).

Ложноположительные сыворотки в иммуноблотинге выявляются с частотой 1:4. Неспецифическое взаимодействие антител происходит с вирусными белками р18, р24-25 и р55.

Опасность ложноположительных реакций заставляет специалистов использовать разнообразные методы повышения достоверности получаемых результатов. Для этого применяют различные модификации иммуноблотинга, реакции конкурентного иммуноферментного анализа, радиоиммунопреципитации, прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

Задание 10.

Изучите принцип метода молекулярной гибридизации и метод амплификации нуклеиновых кислот.

Метод молекулярной гибридизации и позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Он применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения.

Принцип метода – заключается в способности двунитевой ДНК при повышенной температуре (90°С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°С вновь восстанавливать исходную двунитевую структуру.

Метод требует наличия молекулярного радиоактивного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радионуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в последнем ДНК микроба без выделения этого микроба в чистую культуру. Для осуществления этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, а наличие возбудителя определяют по обнаружению в выделенной ДНК специфичного для искомого микроба гена.

Полимеразная цепная реакция с использованием метода молекулярной гибридизации состоит из 4-х стадий:

1. Денатурация ДНК.

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд.

Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль.

2. Связывание праймеров с комплементарными участками гена, образование репликативной вилки.

Добавляют праймеры, комплементарные З'-концам ДНК искомого гена. Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками.

3. Добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов, синтез гена.

Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена.

4. Повторение цикла.

После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза.

Реакцию проводят в специальных приборах — амплификаторах.

Во время следущей процедуры – амплификации – в образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание ПЦР: два вида праймеров, два энзима (Tag-ДНК-полимераза и N-урацилгликолаза) и 4 вида нуклеотида А, Г, Ц, У.

Для проведения ПЦР используется специальное устройство (термоциклер или ДНК-амплификатор), позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. В первом цикле осуществления ПЦР образец нагревается до температуры 94^оС для разделения двух комплементарных нитей ДНК. Затем температура снижается до 40-60^оС, при этом праймеры присоединяются к единичной цепи ДНК, после чего температура вновь поднимается до 72^оС (при которой наиболее выражена активность полимеразы). Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3-х минут.

Для контроля реакции амплификации используются контроли. В качестве «положительного контроля» используют препарат ДНК искомого микроорганизма. «Положительный контроль» позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции.

Для контроля хода амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль». Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма.

Существует 6 основных способов, при помощи которых можно повысить количество амплифицированной ДНК (усилить ПЦР-сигнал) при низкой концентрации ДНК-матрицы (вируса, бактерии, мутантных генов):

1. Усиление денатурации ДНК-матрицы: денатурировать ДНК при 94-99^оС до начала ПЦР или удлинить начальную денатурацию до 305 минут.

2. Увеличение специфичности праймеров.

3. Подбор оптимальных концентраций реагентов и температуры отжига.

4. Применение «горячего старта»: произойдет увеличение выхода специфического продукта ПЦР.

5. Увеличение продолжительности ПЦР до 40 циклов и использование ПЦР с «вложенными» праймерами.

6. Применение более чувствительной гибридизационно-ферментативной детекции амплифицированной ДНК.

Возможно осуществление одновременного определения нескольких инфекий в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакций – метод мультиплексной (мультипраймерной) ПЦР. Для этого в амплификационную смесь добавляется равный объем растворов праймеров для различных инфекций, при этом объем добавляемой деионизированной воды уменьшается на объем дополнительно добавленных раствором праймеров. Следует, однако, отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому, рекомендуется одновременно определять не более 3-х инфекций за одну реакцию.

Задание 11

Изучите виды тест-систем, используемых для постановки ИФА, ПЦР (запишите в дневник название тест-системы и ее практическое применение):

1.

2.

3.

4.

5.

Оценка _____________

Подпись преподавателя _____________