Занятие ТЕМА: «Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых гемофилами».

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых гемофилами».

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению таксономии, морфологии, методов лабораторной диагностики гемофилов.

2. Изучить правила забора, хранение и транспортировки биологического материала при инфекциях, вызываемых гемофилами.

4. Овладеть методикой и техникой бактериоскопического и бактериологического методов диагностики гемофилов.

5. Изучить методики и провести постановку тестов идентификации гемофилов.

6. Изучить экспресс – методы обнаружения капсульного антигена (латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, реакция встречного иммуноэлектрофореза).

II Самостоятельная работа

Задание 1

Познакомьтесь с нормативной документацией, регламентирующей микробиологическую диагностику гемофилов:

1. Микробиологические методы исследования биологического материала. Инструкция от 13.03.2010г. Р № 075-0210.

2. Временные методические рекомендации по забору и транспортировке биологического материала на гемофильную инфекцию № 02 -19/ 1638 от 21.06.2007г., ГУ «ГОЦГЭ и ОЗ», Шерендо Я.М.

3. Приказ № 68/ 14-с от 13.02.2007г «О формировании системы эпидемиологического надзора за гемофильной инфекцией».

Задание 2

Изучите правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала – кровь, спинномозговая жидкость, мокрота - по рекомендациям по забору материала на гемофильную инфекцию ГУ «ГОЦГЭ и ОЗ», Гродно, 2007(см. Приложение № 1).

Задание 3

Изучите по таблицам морфологические свойства гемофилов, зарисуйте в дневник и подпишите (см. Приложение № 2).

Задание 4

Приготовьте питательные среды, используемые при выделении гемофилов:

1. Кровяной агар

Способ приготовления: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 45°-50⁰С С питательного агара,соблюдая правила асептики,добавте 5% (5 мл кровина 100 мл питательной среды) сердечно - мозгового экстракта или дефибринированной крови человека, разлейте в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

2. Шоколадный агар (с гретой кровью)

Принцип.Прогревание крови способствует освобождению из

эритроцитов факторовроста X (гемин) иV

(никотинамидадениндинуклеотид), необходимых длякультивирования

гемофилов.

Способ приготовления: к 100 мл расплавленного и охлажденногодо

80°С питательного агара добавте 10 мл дефибринированной

крови человека, тщательно перемешайте, после чего помещайтев

водяную баню и, постоянно встряхивая, держите при температуре 70°С-

80°С до тех пор, пока цвет агара не станет шоколадным (25-30 мин.),

разлейте в стерильные чашки Петри.

3. Шоколадный бульон

Способ приготовления: к 180 мл питательного бульона добавте 18 мл

крови (9 мл эритоцитной массы и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота)

и 9 мл дрожжевого экстракта, разлейтев стерильные пробирки.

Задание 5

Изучите питательные среды, используемые для культивирования гемофилов (демонстрации сред), зарисуйте в дневник, опишите характер роста гемофиловна данных средах (см. Приложение № 3).

1 2 3

Характер роста на средах:

1.

2.

3.

Задание 6

Проведите 1-й этап бактериологического исследования материала (мокроты) с целью выделения гемофилов.

Алгоритм проведения I-ого этапа бактериологического

исследования при выделении гемофилов:

1. Сделайте два мазка из мокроты. Окрасьте один мазок по методу Грама-Синева,второй - по методу Бурри- Гинса. Изучите их под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте предварительное заключение.

Окраска по методу Окраска по методу

Грама-СиневаБурри-Гинса

Заключение:

Примечание: при окраске по Граму- Синева бактерии Haemophilus мелкие, бледно окрашенные грам (–) палочки , поБурри – Гинсу бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными, резко выделяющиеся на черном фоне.

2. Проведите посев исследуемого материала (мокроты) на кровяной агар шпателем. Посевы инкубируют 37⁰С 24 часа.

Задание 7

Изучите методики и проведите постановку тестов идентификации гемофилов.

Биохимическая идентификация микроорганизмов рода Haemophilus

(см. Приложение № 4).

Алгоритм

проведения III-его этапа бактериологического исследования

с целью выделения гемофилов:

1. Проверьте однородность выделенной чистой культуры, сделайте мазок со скошенного СПА, окрасьте по Граму – Синеву, изучите под микроскопом, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

2. Ставят тест на способность к продукции цитохромоксидазы: материал исследуемой суточной агаровой культуры наносят на фильтровальную бумагу и добавляют 1 каплю 1%-ногосвежеприготовленного водного раствора тетраметилпарафенилен -диамина гидрохлорида; при наличии цитохромоксидазы спустя 5-10 секунд развивается пурпурное окрашивание. В качестве позитивного контроля компонентов реакции следует использовать суточную агаровую культуру любой псевдомонады, в качестве негативного – кишечной палочки. Тест может быть выполнен непосредственно на поверхности чашки: в этом случае 1 капля реактива наносится на исследуемую колонию и учет результатов аналогичным образом производится спустя 23-30 сек.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

3. Ставят тест на способность к продукции каталазы: материал исследуемой суточной агаровой культуры суспензируют на поверхности предметного стекла в капле 3%- ного раствора перекиси водорода; спустя 3-5 сек во взвеси каталазапозитивной культуры происходит интенсивное газообразование. В качестве позитивного контроля следует использовать суточную культуру кишечной палочки, негативного – любого стрептококка.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:______________________________________________________

4. Ставят тест на b- галактозидазу: в стерильныеагглютинационные пробирки разливают по 0,5 млраствора b - галактозидазы и вносят одну петлю культуры, инкубируют 37° С 2- 4часа и появление ярко-желтого окрашивания за счет о-нитрофенола.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

5. Ставят тест на определение индолообразования: пробирки с питательным бульоном засевают одну петлю культурыи добавляют 2-3капли инактивированной лошадиной сыворотки, под пробку помещают индикаторную бумажку на индол. При образовании индола при инкубации 37°С 18-24часа, появляется розовое окрашивание индикаторной бумажки.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

6. Ставят тест на определение уреазы:в пробирки по 0,1 мл и вносят несколько капель густой суспензии исследуемой культуры в питательном бульоне, инкубируют 37^оС, 30 мин, среда приобретает малиново-красное окрашивание.Учет отрицательной реакции после 24 часов инкубации, цвет среды не изменяется.

Результат:_________________________________________________________

Заключение:_______________________________________________________

7. Ставят тест на наличие орнитиндекарбоксилазы: диски с орнитином помещают в пробирку с 0,3–0,5 мл физиологического раствора и добавляют несколько капель суточной бульонной культуры, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом и инкубируют 37^оС 18–24 часа, появляется синее или интенсивное зеленое окрашивание.

Результат:________________________________________________________

Заключение:______________________________________________________

8. Ставят тест на определение потребности для роста X и Y факторов: приготовленная суспензия суточной культуры в питательном бульоне, засевают на 5% кровяной агар, на поверхность среды кладутстандартные

диски или полоски, пропитанные X и Y факторами, на расстояние 2 см друг от друга. Инкубируют 37^оС в атмосфере18–24 часа с 5–10% СО².

Учет характера роста производится визуально. Интенсивный рост бактерий вокруг дисков или полосок подтверждает наличие гемофилов.

9. Реакция определения феномена «набухания капсулы»: в свежевыделенной мокроте устанавливают набухание капсулы при воздействии соответствующих диагностическихагглютинирующих сывороток, основано на появлении феномена набухания капсулы.

10. Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикамметодом диффузии в агаре на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 5% дефибринированной крови человека, разлитой по чашкам с толщиной слоя агара 4 мм. Перед посевом подсушить чашки с приоткрытыми крышками при +25±5⁰С. Готовые чашки хранить не более 7 дней в холодильнике, в запаянном полиэтиленовом пакете. Берут 18-20-часовую агаровую культуру. В стерильном ИХН суспензируют 5-10 изолированных колоний и доводят до 0,5 мутности по оптическому стандарту Mc Farland. Стерильный ватный тампон поместить в пробирку с инокулятом. Излишнюю жидкость с тампона убрать путем покручивания тампона, прижатого к стенке пробирки над уровнем жидкости в разные стороны. Посев культуры на каждую чашку произвести штрихообразным движением по всей поверхности агара трижды, каждый раз после аппликации поворачивая чашку вокруг своей оси на 60⁰. В заключении тампоном обводят по краям агаровой поверхности. Диски с помощью стерильного пинцета наложить на поверхность засеянной питательной среды на расстоянии от края чашки 1,5-2см и на одинаковом расстоянии (около 3 см) друг от друга, не более 6-7 дисков на чашку, слегка прижимая их к поверхности среды. Сразу после наложения дисков чашки закрыть крышками и инкубировать при 37⁰С 24 часа. Чашки извлечь из термостата, поместить кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45⁰ (учет в отраженном свете). При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста.

Рекомендуемые диски с антибиотиками: ципрофлоксацин, тетрациклин, хлорамфеникол, амоксициллин, меропенем, цефтазидим.

Учтите результаты по демонстрационной пробе и сделайте заключение с учетом результатов всех тестов идентификации выделенного штамма.

Результат пробы на антибиотики: (см. Приложение №5)

1._________________________________________________________________

2.______________________________________________________________

3.________________________________________________________________

4. ____________________________________________________________

5._____________________________________________________________

6._________________________________________________________________

Задание 8

1. Изучите экспресс – методы обнаружения капсульного антигена (латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, реакция встречного иммуноэлектрофореза). Вспомогательный метод диагностики менингококковой инфекции - реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации

Для диагностики заболеваний, вызванных палочкой инфлюэнцы, используют РИФ. В настоящее время предложены иммунологические методики выявления капсульного антигена H. influenzae типа b в ликворе, крови, плевральной жидкости и моче: латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, встречный иммуноэлектрофорез.

Реакция латекс - агглютинации (экспресс-метод)

Метод латекс - агглютинации, позволяющий в течение 15 мин дать заключение об отсутствии или наличии в спинномозговой жидкости больного специфических антигенов. Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликвореи при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей. Предварительно спинномозговую жидкость необходимо прогреть в течение 5 мин при 100 °С и центрифугировать при 1500 - 2000 об./мин. Для проведения реакции используют прозрачную надосадочную жидкость.

Ход исследования: одну каплю каждого латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору, добавляют 0, 3 мл спинномозговой жидкости (надосадочная фракция). Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту. Агглютинация в течение 2 мин с одним из латекс - диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена.

Встречный иммуноэлектрофорез (экспресс-метод)

Реакция позволяет с помощью специфических антисывороток выявлять полисахаридный антиген возбудителя в спинномозговой жидкости или сыворотке крови больного уже в первый день исследования материала. Для проведения реакции необходимы: проба спинномозговой жидкости (осадок, если ликвор мутный) или сыворотка крови, преципитирующие антисыворотки, веронал - мединаловый буфер, 1 %-й агар на веронал - мединаловом буфере, любой аппарат для иммуноэлектрофореза, стеклянные пластины размером 9 и 12 см, трафареты, пробойники для агара, отсасывающие агар устройства, пастеровские пипетки или дозаторы с наконечниками, фильтровальная бумага, предметный столик или другой объект с идеально ровной поверхностью. В аппарат для иммуноэлектрофореза заливают веронал - мединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,35 г веронала (веронал предварительно нагревают на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды до полного растворения). Измеряют рН и доводят его до уровня 8,6. Далее на веронал - мединаловом буфере (предварительно развести дистиллированной водой в 4 раза) готовят 1 % агар.

Ход исследования: на 100 мл буфера добавляют 1 г агара, нагревают на водяной бане до полного растворения и в горячем, но несколько охлажденном виде (60 - 70 °С) в количестве 20 мл наносят на стеклянные пластины размером 9 и 12 см. Пластину предварительно помещают на ровную горизонтальную поверхность. После застывания агара специальным пробойником или металлической трубкой с диаметром 3 мм высекают два параллельных ряда отверстий по длине стекла на расстоянии 3 мм друг от друга. Специфические антисыворотки вносят в лунки агара со стороны анода (+), а испытуемую пробу спинномозговой жидкости или сыворотку крови - со стороны катода (-). В отдельные лунки помещают положительный контроль. В качестве положительного контроля используют антигенный препарат (полисахарид) и гомологичную антисыворотку. Подготовленную пластину помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза, соединяют стекло и буфер с помощью фильтровальной бумаги и включают аппарат в сеть. Время экспозиции 20 - 30 мин при силе тока 12 ма. Результат учитывают через 10 мин после выключения аппарата. Реакцию считают положительной, если между лунками проявляются четкие линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. Рекомендуется проведение повторного и окончательного учета результатов реакции через 24 ч, при этом стекла хранят во влажной камере или в эксикаторе с влажной атмосферой.

Реакция коагглютинации (экспресс-метод ) - серологический тест, в котором используются стафилококки (носитель протеина А, по отношению к иммуноглобулинуС). Такой носитель, погруженный специфическими антителами, представляет собой диагностикум, который позволяет эффективно проводить детекцию разнообразных растворимых антигенов, а также антител.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Исследование сыворотки больного в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации позволяет существенно увеличить процент лабораторного подтверждения генерализованных форм менингококковой инфекции. Для получения достоверного результата обязательным условием является исследование сывороток крови больного в динамике, т.е. взятых в разные сроки заболевания (на 1-й и 10 - 12-й дни заболевания). Одной из модификаций микрометода является постановка РНГА в полистироловых пластинах с объемом лунок не менее 300 мл с использованием автоматических дозаторов на 0,5 и 1 мл. Необходимые реагенты: диагностикумы эритроцитарные менингококковые полисахаридные серогрупп А и С; исследуемая сыворотка, разведенная 1:5; забуференный физиологический раствор (ЗФР).

Ход исследования: два ряда полистироловой пластины (для выявления антител к менингококкам серогрупп А и С) заполняют по 1 мл ЗФР, затем проводят двукратное титрование исследуемой сыворотки с разведения 1:5. В каждый ряд добавляют по 0,5 мл соответствующего диагностикума. Пластину встряхивают и помещают в термостат на 2,0 - 2,5 ч при 37 °С, после чего учитывают результаты. Обязательными контролями служит отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума и исследуемой сыворотки. Для этого к 1мл диагностикума добавляют 0, 50 мл ЗФР, а к 1 мл сыворотки -0, 5 мл 1 %-х эритроцитов барана. Учет результатов РНГА проводят по четырехкрестной системе. Четырехкратное и более нарастание титра специфических антител в процессе болезни служит подтверждением диагноза.

Экспресс-метод – иммуноиндикация с помощью реакции иммунофлюоресценции со специфической сывороткой типа b (используют при диагностике менингитов).

Оценка ___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение № 1

ПРАВИЛА ЗАБОРА МАТЕРИАЛА ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Общие требования.

1. Биоматериал должен отбираться:

·до начала антибиотикотерапии терапии или перед введением следующей дозы антибиотика с учетом времени его элиминации;

·непосредственно из очага инфекций либо биопробы, отражающих процесс в тех или иных органах и системах (бронхиальный секрет при пневмониях, моча при инфекциях МВП и др.);

·с соблюдением асептики, избегая контаминации посторонней флорой;

·в достаточном количестве для проведения исследования и помещаться в стерильную посуду.

2. Доставляться в максимально короткие сроки (1,5-2 часа либо с применением транспортных сред).

3. Необходимо правильно заполнять сопроводительные документы (направления).

КРОВЬ

Показания для проведения микробиологического исследования:

·клиническая картина сепсиса;

·лихорадочные состояния неустановленной этиологии;

·подозрение на инфекционные заболевания.

При заборе крови необходимо соблюдать меры индивидуальной защиты от возбудителей инфекций, передающихся через кровь.

Взятие исследуемого материала:

- взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода;

- до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата.

Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики. Используют стерильные 20-граммовые (для детей 10-граммовые) шприцы с иглами для венопункции.

Кровь берут у постели больного или в процедурном кабинете в первую очередь после УФ-облучения и тут же засевают на питательные среды. Данную манипуляцию необходимо проводить вдвоем: один медицинский работник проводит обработку кожи больного, венопункцию и взятие крови, второй, в это время открывает над пламенем спиртовки пробки флаконов со средами, подставляет их под струю крови из шприца, обжигает горла флаконов и закрывает их. Флаконы со средой необходимо хранить в холодильнике, а перед посевом (за 30-60 минут) выдержать при комнатной температуре. С момента посева и до транспортировки в лабораторию флакон также содержат при комнатной температуре.

Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70^оспиртом, затем 5% настойкой йода и опять спиртом, во избежание раздражения кожи. Венопункцию проводят после полного высыхания дезинфектанта.

Производить забор крови из центральных венозных катетеров (кроме подозрения на катетерассоциированные инфекции) запрещается!

Соотношение крови и среды должно быть 1/10 для устранения бактерицидного действия крови путем ее разведения. (Следует отметить, что увеличение объема засеваемой крови в значительной мере увеличивает вероятность получения положительного результата). Согласно отечественным нормативным документам кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл.

При отсутствии флаконов со средой (в случаях крайней необходимости), разрешается производить забор крови в 20 мл. шприц, в который предварительно набирают 0,5-0,7мл. стерильного гепарина. Не снимая иглы, и надев колпачок, немедленно отправляют в лабораторию.

ЛИКВОР

Показания для проведения микробиологического исследования:

·все случаи предполагаемого менингита;

·осложнения после черепно-мозговых травм, нейрохирургических операций.

Взятие исследуемого материала:

Ликвор получают путем люмбальной пункции, реже при пункции боковых желудочков мозга. Желательно взять материал сразу при поступлении больного в стационар, до начала лечения.

Пункция и взятие материала проводятся с соблюдением всех правил асептики.

Первую порцию ликвора берут в отдельную пробирку для проведения общего клинического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, собирают в стерильную центрифужную пробирку в количестве 1-2 мл. Ликвор рекомендуется наливать в пробирку шприцем без иглы.

Нельзя касаться руками краев канюли, иглы, пробирки, класть пробку на нестерильные поверхности!

Образец должен быть немедленно доставлен в лабораторию. Если это невозможно, в течение нескольких часов материал сохраняют в термостате при 37^оС или в термосе. Во время транспортировки ликвор необходимо оберегать от охлаждения и перегревания, так как в противном случае некоторые микроорганизмы могут погибнуть. Для транспортировки используют изотермические емкости, грелки с теплой водой и т.д.

ОТДЕЛЯЕМОЕ ИЗ НИЖНИХ ОТДЕЛОВ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Показания для проведения микробиологического исследования:

·воспалительные заболевания нижних отделов дыхательных путей.

Взятие исследуемого материала.

Материалы, исследуемые при инфекциях нижних дыхательных путей:

• мокрота (наиболее доступный материал, часто с неоднозначной трактовкой результатов);
• плевральная жидкость;
• трахеобронхиальные смывы (часто значительное разведение материала снижает возможность выделения микроорганизмов);
• пунктат инфильтрата, абсцесса;
• браш-биоптат (из глубины бронхов специальной канюлей с защитными щеточками)- наиболее достоверный результат.

Перед сбором мокроты больному предлагают почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Предпочтительным является исследование утренней порции мокроты. Мокроту собирают в стерильную широкогорлую банку.

Исследование промывных вод бронхов проводят при отсутствии или скудности мокроты. Это связано не только с технической сложностью взятия этого вида материала, но и с меньшей диагностической ценностью результата, из-за его значительного разбавления (концентрация микроорганизмов в промывных водах в 10-1000 раз меньше, чем в мокроте). Бронхиальные смывы могут быть получены при бронхоскопии. В этом случае не рекомендуется вводить в бронх более 5 мл физиологического раствора.

Приложение № 2

Семейство Pasteurellaceae, род Haemophilus. Некислотоустойчивые факультативно-анаэробные облигатные паразиты, для роста которых необходимы ростовые факторы XY, содержащиеся в эритроцитах. Мелкие неподвижные полиморфные бактерии (кокковиднаяили палочковидная форма), грамотрицательные. Спор не образуют, отдельные виды формируют капсулу.

Приложение № 3

Рост культуры Haemophilus на кровяном агаре (мелкие полупрозрачные колонии, зона гемолиза отсутствует)

Приложение № 4

Биохимическая идентификация микроорганизмов рода Haemophilus

Н. influenzae и Н.ducrey – патогенные микроорганизмы для человека.

Н. parainfluenzae; Н. Haemolyticus; Н. parahaemolyticus – условно - патогенные микроорганизмы.

Примечание: ОДК – орнитиндекарбоксилазная активность

Приложение № 5

Таблицы: «Интерпретация диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диск-диффузии» гемофильной палочки.

Примечание:резистентный – устойчивый, умеренно резистентный – промежуточный.