Тема: «Санитарно-бактериологическое исследование почвы».

I План занятия.

1. Закрепить знания по изучению санитарно-бактериологических показателей, используемых для санитарно-бактериологического исследования почвы населенных мест.

2. Овладеть методикой проведения санитарно-бактериологического исследования данного объекта..

3. Научиться производить учет, оценку и оформление результатов исследования.

II Самостоятельная работа.

Задание 1

Познакомьтесь с документацией регламентирующей санитарно-бактериологичесские исследования почвы.

▪ГОСТ 17.4.4.02.84 «Почва. Методы отбора проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа».

▪Инструкция 4.2.10-12-9 2006 «Методы санитарно-микробиологического исследования почвы».

▪Показатели определяемые при санитарно-микробиологическом исследовании почвы:

▪БГКП

▪ОКМ

▪Энтерококки

▪Cl. perfringens

▪Термофильные бактерии

▪Почвенные сапрофиты

▪Грибы и актиномицеты

▪Амофикаторы почвы

▪Целлюлозо-разлагающие бактерии

▪Определение токсичности почв

▪Обнаружение сальмонелл, шигелл

▪Патогенных клостридий

▪Сибироязвенной палочки

▪Санитарно-вирусологическое исследование почвы

Задание 2

Ознакомьтесь с правилами отбора проб почвы для бактериологического исследования:

-пробы почвы отбирают не менее чем с 2-х участков площадью 25м², причем один из них должен находиться вблизи источника загрязнения (свалки, мусорные ящики, выгребные ямы), другой – в отдалении от них (контроль);

-для составления среднего образца (1 кг) на каждом участке пробы отбирают в 5-ти точках по диагонали или в 4-х точках по краям и 1-ой в центре по 200-300 г почвы из каждой точки;

-пробы берут с глубины 20 см специальным инструментом (маленькая лопатка или совок), образцы из глубоких слоев почвы (0,75-2 м) берут буром;

-инструменты перед взятием проб необходимо обеззараживать, т.е. обмывать, обтирать спиртом и обжигать;

-из среднего образца 200-300 г почвы переносят в стерильную банку, закрывают ватной пробкой; горлышко банки обертывают бумагой и перевязывают, банку нумеруют, записывают необходимые данные (дата, место отбора проб и др.), укладывают в деревянный ящик с гнездами и немедленно отправляют в лабораторию;

-в лаборатории почву просеивают через стерильные сита с отверстиями 3 мм, образец перемешивают и их него отбирают навеску 30 г для разведения;

-при невозможности провести бактериологическое исследование в день отбора пробы, допускается хранение ее не более 24 часов при температуре 1-2⁰С.

Задание 3

Проведите подготовку пробы почвы к исследованию.

1. Возьмите колбу с пробой почвы (200-300г) тщательно перемешайте образец почвы, раздробите в стерильной ступке, просейте через стерильное сито на стерильную бумагу и отберите навеску в 30 г.

2. Навеску почвы высыпьте в стерильную колбу емкостью 500 мл и добавьте 270 мл стерильной воды. Получается разведение 1:10.

3. Проведите предварительную обработку почвы путем 10 минутного вертикального встряхивания почвенной суспензии 1-го разведения, закрыв колбу резиновой пробкой, с целью извлечения клеток микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц.

4. Через 30 секунд, чтобы осели грубые минеральные частицы, из почвенной суспензии 1:10, содержащей в 1 мл 0,1 г почвы, готовят последовательно убывающие концентрации почвы. Для этого из 1-го разведения 1 мл отбирают стерильной пипеткой и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды, получая 2-ое разведение почвы 1:100. Повторяют эту операцию и доводят разведение почвы до 1,0001-0, 00001 г/м.

ВНИМАНИЕ! Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки!

Задание 4

Приготовьте питательные среды:

1. Молоко по Тукаеву в объеме 50 мл.

Способ приготовления: К 50 мл 1% пептонной воды добавляют 5-6% цельного молока. Среду разливают в стерильные бактериальные пробирки по 5 мл.

2. Среду Кесслера- Свенертона

Способ приготовления: К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл желчи. Смесь кипятят 30 минут, фильтруют, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем водой до 1 л, устанавливают рН 7,8 – 8,2. Добавляют 4 мл 1% водного раствора генцианового фиолетового для подавления роста грам + бактерий. Разливают и стерилизуют 15 минут при 120 º С.

3. Среду Эндо по прописи на этикетке в объеме 200 мл и разлейте в стерильные чашки Петри.

4. Расплавьте стерильный СПА во флаконе на водяной бане, охладите до 45 º–

50º С.

Задание 5

Проведите определение в почве общего количества микроорганизмов (ОКМ), учтите результат.

Алгоритм определения ОКМ

1. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее 2-х различных разведений (1:10-1:1000000).Причем из каждого разведения посев производят минимум на 2 чашки.

2. Перед посевом каждое разведение почвы перемешивают стерильной пипеткой.

3. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. На крышке чашки предварительно указывают № пробы и разведение, например 411; 0,01.

4. Затем в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45⁰С питательный агар (15-20 мл, т.е. высота слоя агара равна 4-5мм).

5. Чашку Петри с агаром хорошо перемешивают с имеющейся там суспензией почвы и оставляют до застывания среды. Затем ставят в термостат дном вверх при 37⁰С на ночь.

6. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчет на 1 г абсолютно сухой почвы. Расчет производится по следующим формулам:

Nc=n*a, где

Nc — количество клеток бактерий в 1 г сырой почвы, а — степень десятикратного разведения, n — число колоний, выросших на чашке (берется среднее арифметическое из всех чашек);

N=(Nc*100%):(100%-C%),где

N — количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы, С — влажность исследуемой почвы (%).

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Задание 6

Проведите определение БГКП титрационным (бродильным) методом в1 г почвы.

Алгоритм определения БГКП

1. Для постановки 1-ой бродильной пробы из 1-го разведения почвы (1:10) стерильной пипеткой берут 10 мл и засевают во флакон с 50 мл среды Кесслера-Свенертона, что соответствует 1г почвы. Посев меньших количество почвы (01; 0,01; 0,001; 0,0001; 0,00001г) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл той же среды с поплавками. Выращивают посевы при 37⁰С 24 часа.

2. Из забродивших посевов производят высев на секторы чашки Петри со средой Эндо. Чашки с посевами помещают на 24 часа при 37⁰С.

3. При наличии колоний, типичных для кишечной палочки, из них готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. У грам- палочек проверяют оксидазную активность. Оставшуюся часть колоний с отрицательной оксидазной активностью пересеивают на полужидкую среду с глюкозой и помещают на 24 часа при 37⁰С.

4. Положительный результат II-ой пробы (ферментация глюкозы с образованием кислоты и газа) подтверждает наличие БГКП (в т.ч. E. coli) в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают количеством БГКП (в т.ч. E. coli) в 1г почвы.

Результат: _______________________________________________________________

________________________________________________________________________

Заключение: _____________________________________________________________

________________________________________________________________________

Задание 7

Проведите определение перфригенс-титра в почве, учтите результат и сделайте заключение.

Алгоритм определения перфригенс-титра в почве.

1. По 1 мл из каждого разведения почвенной взвеси засеивают в пробирки с 5 мл молочной среды Тукаева.

2. Посевы прогревают на водяной бане при 80⁰С в течение 15 минут для освобождения от посторонней неспороносной микрофлоры, затем инкубируют при 37⁰С (или при 43⁰С) в течение 12-20 часов.

3. Размножение клостридий перфрингенс сопровождается характерным свертыванием молока в виде сгустков. Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на молочной среде размножение клостридий перфрингенс, означает титр этого микроба в почве.

Результат: _______________________________________________________________

________________________________________________________________________

Заключение: _____________________________________________________________

________________________________________________________________________

Задание 8

Изучите методы санитарно-микробиологических исследований почвы, предусмотренные Инструкцией 4.2.10-12-9-2006 (см. приложение №1, №2)

Оценка _______________

Подпись преподавателя____________

ПРИЛОЖЕНИЕ № 1

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ

1.Выявление и идентификация БГКП:

К БГКП относятся грамотрицательные, не образующие спор короткие палочки, сбраживающие лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа при 37±0,5°С в течение 24-48 часов, не обладающие оксидазной активностью.

При анализе слабо загрязненных почв проводится определение БГКП титрационным методом и методом мембранной фильтрации.

При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведений почвенной суспензии на среду Эндо.

1.1.Метод мембранной фильтрации.

В качестве ускоренного метода для обнаружения БГКП целесообразно использовать метод мембранной фильтрации. При этом через стерильные мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм пропускают 5-10 мл почвенной суспензии первого разведения (1:10). До фильтрования необходимо провести центрифугирование почвенной суспензии при 2000 об/мин в течение 5 минут.

После фильтрации мембранные фильтры с адсорбированными на них клетками бактерий осторожно захватывают обожженным пинцетом за край и накладывают на поверхность среды Эндо избегая образования пузырьков воздуха между мембранным фильтром и средой. В чашку можно поместить 4 фильтра. На чашке под каждым фильтром делают надпись с указанием номера пробы и объема профильтрованной суспензии. Чашки инкубируют в термостате при температуре 37°С - 24 часа. При наличии роста отбирают 2-3 типичные колонии для окраски по Граму. Дальнейшую идентификацию проводят аналогично титрационному методу.

1.2.Прямой поверхностный посев.

При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 мл на поверхность среды Эндо. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 1:10-1000000. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24 час. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов согласно титрационному методу.

Результаты анализа последними двумя методами можно выразить в коли-титре или коли-индексе.

2.Выявление и идентификация энтерококков.

Энтерококки – грамположительные кокки, расположенные парами короткими или длинными цепочками, каталазоотрицательные, спор и капсул не образуют. Для всей группы энтерококков характерны: устойчивость к 40% желчи, 6,5% хлористого натрия, рН – 9,6-9,2, не ферментируют раффинозу и не разлагают Н₂О₂, рост в молоке с 0,1% метиленового синего.

Наиболее эффективным приемом предварительной обработки почвенной суспензии является обработка ее низкочастотным ультразвуком, но допустима обработка почвенной суспензии путем встряхивания в пробирках.

Приготовление десятикратных разведений почвенной суспензии проводят по стандартной методике.

3.Методы определения энтерококков.

3.1.Титрационный метод.

При анализах почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения посев проводится титрационным методом из десятикратных разведений почвенной суспензии в жидкую среду обогащения (растворы Хэнкса или Эрла (температура инкубации 37⁰С) с последующим через 24 часа высевом на среду для выделения энтерококков. Из выросших колоний, готовят препараты, окрашивают по Граму, проверяют отношение к каталазе и другим тестам.

3.2.Метод прямого поверхностного посева.

Сильно загрязненные почвы анализируются проводя посев поверхностным методом на плотную среду (энтерококкагар и др.) в количестве 0,1-0,05 мл в разведении 1:10-1000000. Идентификация проводится аналогично тестам.

3.3.Капельный посев.

В чашки Петри с питательной средой (энтерококкагар и др.) наносят микропипеткой по 6-10 капель (0,01 мл) из десятикратных (1:10-1000000) разведений почвенной суспензии. Посевы выдерживают на столе, до подсыхания капель, а затем помещают в термостат крышкой вверх. Термостатируют при 37°С - 24 часа. Идентификация проводится аналогично тестам.

Во всех методах делается перерасчетколичества определяемых энтерококков на 1 г почвы с учетом влажности.

4.Выявление и идентификация С. perfringens.

4.1.Из приготовленных почвенных разведений (до 1:10-1000000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С - 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл среды Вильсон-Блер. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24 часов. При обнаружении колоний черного цвета различной интенсивности готовят мазки и окрашивают по Граму. Наличие в мазках грамположительных палочек с закругленными концами расположенными в одиночку, попарно, в виде цепочек или штакетообразных скоплений указывает на возможность присутствия C. рerfringens. Сбраживание лакмусового молока, ферментации глюкозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, галактозы с образованием кислоты и газа, отсутствие ферментации маннита и дульцита указывает на наличие C. perfringens.

4.2.Использование сред накопления для определения C. perfringens.

По 1 мл прогретых (80°С – 15 мин) и нативных почвенных разведений высевают в пробирки с предварительно регенерированной кипячением среды Китт-Тароцци. После инкубации (18-20 часов) при 37°С производится высев в количестве 0,5-1,0 мл из помутневших пробирок в среду Вильсон-Блер. Инкубация в термостате 37°С – 24 часа. Дальнейшие исследования проводят аналогично п. 20.1. Титр C. perfringens 0,01 и выше указывает, что почва чистая, 0,009-0,0001 – загрязненная, 0,00009 и ниже – сильно загрязненная.

5.Выявление и идентификация термофильных бактерий.

Термофилы представлены полиморфной группой преимущественно спорообразующих бактерий, способных размножаться при температуре 50-70°С. Во внешней среде термофилы обнаруживаются на субстратах, загрязненных навозом или компостами. В процессе гниения в этих субстратах поднимается температура, оптимальная для размножения бактерий.

Посев производят из разведений 1:10-1000000 на 2 параллельные чашки Петри с МПА. Инкубируют 60±2°С – 24 часа. Расчет производят на 1 г абсолютно сухой почвы согласно п. 16.3. Содержание термофильных бактерий в 1 г почвы в количестве 100-1000 указывает, что почва чистая, 1001-100000 – загрязненная, 100001-4000000 – сильнозагрязненная.

6.Определение нитрифицирующих бактерий.

Согласно определителю бактерий Берджи (9-ое издание) нитрифицирующие бактерии разделены на две секции соответственно окисляемому соединению азота: А – бактерии, окисляющие нитрит; В – бактерии окисляющие аммиак.

Бактерии, окисляющие нитрит (род Nitrospira, Nitrbacter, Nitrospina) морфологически разнообразны: палочковидные, эллипсоидные, спиралевидные. Грамотрицательные – аэробы, в присутствии органических субстратов и нитратов образующие NO и N₂O.

Бактерии, окисляющие аммиак: палочковидные, сферические, спиральные или дольчатые формы. Грамотрицательные – аэробы, хемоавтотрофы, используют в качестве энергетического субстрата аммиак и как основной источник углерода СО₂.

Численность этих микроорганизмов указывает на степень органического загрязнения, скорости и окончание распада органики в почве.

Титр нитрифицирующих бактерий 0,1 и выше указывает, что почва чистая, 0,09-0,001 – загрязненная, 0,0009 и ниже – сильно загрязненная.

Определение нитрифицирующих бактерий производится посевом разведений почвенной суспензии 1:10-1000000 на жидкую минеральную среду Виноградского. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14-15 суток.

При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно появляется азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота проверяется на 5-7 день и повторно на 14-15 день. Титр нитрифицирующих бактерий устанавливают с помощью качественной пробы с дифениламином. Для этого пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона переносится на стеклянную или фарфоровую пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий.

7. Методы определения численности почвенных сапрофитов.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов на питательных средах.

Навеску почвы, используемую для приготовления первого разведения, доводят путем добавления небольшого количества стерильной дистиллированной воды до пастообразного состояния, растирают в течение 5 мин. Затем готовят первое разведение (1:10). Почвенная суспензия охлаждается при 5-7°С в течение 20-30 мин. По истечении срока охлаждения проводят раститровку почвенной суспензии 1:10-1000000.

Посев производят на поверхность почвенного агара разлитого в чашки Петри. Термостатируют засеянные чашки при 28-30°С в течение 72 часов. Учет анализа и расчет общей численности почвенных микроорганизмов проводят как и при определении общего количества бактерий.

8. Определение общего числа и процента почвенных бацилл.

Этот показатель является индикатором глубины минерализации органического субстрата.

Почвенные разведения 1:10-1000000, предварительно прогретые при 80°С в течение 15 минут, засевают на поверхность МПА, Сабуро или почвенного агара. Инкубирование в термостате 37°С – 24 часа. Учет производится по общепринятой методике.

9. Определение количества грибов и актиномицетов в почве.

Actinomycetales – бактерии, по внешнему виду сходны с мицеллярными грибами. От грибов отличаются строением ядра, клеточной стенки. Бывают подвижные и спорогенные виды. Капсул не образуют. Грамположительные или грамотрицательные. Размножаются с помощью спор. Основная среда обитания почва. Разлагают органические субстраты. Играют важную роль в круговороте веществ и энергии, образовании почвы и ее плодородии. Многие актиномицеты растут на обычных питательных средах: МПА, кровяном агаре. Колонии обычно появляются на 3-4 сутки, воздушный мицелий – на 7-14 сутки. Оптимальная температура роста 25-30°С.

Для учета грибов используют разведения почвенной суспензии 1:10-1:100, а при учете актиномицетов - 1:100-1:10000. Посев производят поверхностным способом, нанося на среду МПА 0,1 - 0,05 мл суспензий. Для учета актиномицетов используется МПА, кровяной агар и др., при учете грибов – среда Сабуро.

10. Определение аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов.

Данная группа микроорганизмов осуществляет самоочищение почвы от остатков растительного происхождения. Для учета этих микроорганизмов используют посев разведений почвенной суспензии в жидкую среду Гетчинсона. Среда разливается в пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу. Разведения почвенной суспензии 1:10-1000000 засевают по 1 мл. Учет производится через 15-20 суток (инкубация при 28°С) по разложению полосок фильтровальной бумаги и образованию колоний микроорганизмов на них.

11. Определение аммонификаторов в почве.

Аммонифицирующие микроорганизмы (протей, псевдомонады, клостридии, актиномицеты и др.) осуществляют ферментацию азотсодержащих органических соединений, превращая их в аммиак и его соли – обязательное и важное звено в круговороте азота в природе. Разведения почвенной суспензии 1:10-1000000 засевают по 1 мл на жидкие пептонные среды (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными лакмусовыми бумажками, обнаруживающими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака окрашиваются в красный цвет). При определении этого показателя в жидких средах определяют титр аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25-30°С.

12. Определение токсичности почв к микроорганизмам.

Метод определения степени токсичности почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения ориентировочных данных о самоочищающей способности почвы от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов.

12.1. Методы определения и оценка степени токсичности почвы.

Степень токсичности почв отдельных территорий оценивается по классам:

отсутствие — 0-20% токсичных образцов;

слабо выраженная —21-40% токсичных образцов;

средняя — 41-60% токсичных образцов;

сильно выраженная — 61-80% токсичных образцов;

абсолютная —81-100% токсичных образцов.

Для определения токсичности почв можно использовать два метода – качественный и качественно-количественный.

12.2. Качественный метод.

В стерильную чашку Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тест-микроорганизм (Salmonella enteritidis, Echerichia coliАТСС 11229). Затем чашки переносятся в бокс и устанавливаются на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5% агар-агаром в количестве около 10 мл с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится МПА также в количестве 10 мл. С одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.

Посевы производятся петлей, в качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные среды, но без почвы.

Посевы инкубируют при температуре 37⁰С 24 часа. Учет результатов начинается с просмотра контрольного посева.

Распределение выросших колоний на всей поверхности среды свидетельствует о том, что исследуемая почва не токсична (Н/Т), а в случае роста колоний только на участке под которым нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т).

12.3.Качественно-количественный метод.

В стерильную чашку Петри вносится 10 г почвы, распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится агар-агар и МПА. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.

На матовую поверхность мембранных фильтров (0,45 мкм) простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуется кипячением обычным способом. Затем на поверхность питательной среды помещаются мембранные фильтры в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производится посев бактериальной петлей культуры индикаторного штамма (Salmonella enteritidis, Echerichia coli АТСС 11229), суспендированного в физиологическом растворе, содержащем около 10⁹бактериальных клеток по оптическому стандарту мутности. Посевы инкубируются в термостате 24 часа при температуре 37⁰С;

Учет результатов производится путем подсчета выросших колоний от количества точек посев. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100-Р.

На фильтрах отсутствуют колонии – оценивается как абсолютная токсичность, на фильтрах из всех посевов отмечен рост колоний – оценивается как отсутствие токсичности, на фильтрах отмечен рост только части засеянных колоний – различная степень токсичности.

13. Обнаружение и идентификация сальмонелл и шигелл проводится по общепринятой методике.

14. Методы индикации патогенных клостридий в почве.

Идентификация и выделение столбнячной палочки. Основным методом обнаружения C. tetani в почве является биологическая проба на лабораторных животных. Существует несколько способов подготовки образцов почвы к исследованию.

14.1. Первый способ - исследование нативных почв.

Предварительно образцы почв хорошо перемешивают в стерильных (обожженных спиртом) лотках, отбирают 3-5 г почвы, которые переносят в стерильные фарфоровые ступки и тщательно растирают, после чего добавляют 6-8 мл физиологического раствора, перемешивают и оставляют на 1-2 часа при комнатной температуре. Из полученной взвеси по 1 мл внутримышечно вводят двум белым мышам в правую заднюю лапку (в бедро); морским свинкам можно ввести 3-5 мл взвеси. При наличии столбнячной палочки в почве через 2-3 дня у мышей развивается типичная картина столбняка. Для окончательного решения вопроса о наличии столбнячной палочки в исследуемом образце ставят реакцию нейтрализации с противостолбнячной сывороткой.

14.2. Второй способ - методы пастеризации:

первый метод - исследуемый образец почвы, взвешенный в изотоническом растворе в соотношении 1:2-1:10 прогревают во флаконах на водяной бане при температуре 90°С в течение 10 минут. Затем взвесь помещают в аппарат для встряхивания на 10-15 минут, после чего отстаивают в течение 1-2 минут и по 1-1,5 мл надосадочной жидкости внутримышечно вводят в правую заднюю лапку 2-м белым мышам. Учет производится как и при введении животным взвеси из нативной почвы;

второй метод - исследуемый образец в чашках Петри высушивают в термостате при температуре 37°С в течение 50 минут, затем растирают в стерильной ступке до порошкообразного состояния и просеивают через 3-мм стерильное сито. Затем образец прогревают при температуре 80°С в течение 30 минут, 2 г прогретой почвы помещают в стерильные пробирки, добавляют 6 мл стерильного физиологического раствора и снова прогревают при температуре 60°С в течение 1 часа. Этот материал в количестве 1-1,5 мл вводят белым мышам аналогично как было указано в п. 31.1. Контрольным животным за 48 часов до опыта необходимо ввести от 0,1 до 3 АЕ противостолбнячной сыворотки.

Гибель первой группы животных с характерными симптомами (функции конечностей нарушаются, хвост вытягивается, возникает искривление позвоночника) наряду с выживанием контрольных мышей указывает на наличие C. tetani в исследуемых образцах.

14.3. Третий способ - метод с подращиванием на питательных средах:

нативную и прогретую при 80°С в течение 15-20 минут почву засевают в питательные среды для культивирования анаэробных микроорганизмов (Китт-Тароцци, бульон с печеночной вытяжкой). Биологическую пробу на белых мышах ставят путем введения им культуральной жидкости на 3-4 сутки инкубации. При этом методе опытным животным предварительно вводят противогангренозные сыворотки, а контрольным – противогангренозные и противостолбнячные сыворотки. Учет результатов аналогичен, как и при введении животным почвенных суспензий.

При всех способах предварительной обработки почвы наблюдение за опытными и контрольными животными необходимо вести в течение 10 дней.

Посев в питательные среды позволяет выделить и культуры столбнячной палочки. Выделение C. tetani производится по обычной методике.

14.4. Индикация и выделение C. botulinum из почвы.

Для индикации и выделения возбудителя ботулизма производят посев почвы на среды накопления, преимущественно Китт-Тароцци, бульон с печеночной вытяжкой;

две навески почвы по 20-30 г растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором или 1% пептонной водой и засевают во флаконы с 80-100 мл питательной среды. Один флакон прогревают на водяной бане при 80° в течение 30 минут. Оба флакона инкубируют при температуре 37°С в течение 2-х недель.

Для индикации C. botulinum на 5-е сутки роста по 0,5 мл культуральной жидкости, разведенной 1:2-1:3 физиологическим раствором, вводят 2-м белым мышам внутрибрюшинно. В случае гибели белых мышей на 1-2-е сутки после заражения, ставят реакцию нейтрализации с поливалентной сывороткой с содержанием в 1 мл 10 АЕ каждого типа ботулинической палочки. Для этого 1 мл поливалентной сыворотки смешивают с 1 мл культуральной жидкости, выдерживают 45 минут при комнатной температуре, затем ставят биологическую пробу. Двум мышам внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл нейтрализационной культуральной жидкости, а 2-м культуральную жидкость без сыворотки. Реакция нейтрализации считается положительной, если животные, которым вводили культуральную жидкость без противоботулинической сыворотки, погибли на 1-4-е сутки после заражения с клинической картиной, типичной для ботулизма, а животные, которым вводили смесь культуральной жидкости с противоботулинической сывороткой, остались здоровыми в течение 4 дней или заболевали с нетипичной для ботулизма клинической картиной.

Для определения типа C. botulinumв дальнейшем ставят реакцию нейтрализации с моновалентными противоботулиническими сыворотками типа А, В, С, Д, Е с активностью 10 АЕ в 1 мл. При наличии в пробах почв нескольких типов C. botulinum ставят реакцию нейтрализации с би- или тривалентными сыворотками. Выделение культур C. botulinum производят из сред обогащения, положительных на ботулинический токсин, на 8-14-е сутки. Производят высев на чашки с кровяным агаром с последующим обычным ходом анализа при выделении культур C. botulinum из других объектов.

15. Обнаружение сибиреязвенной палочки в почве.

15.1. Предварительная подготовка проб почвы включает следующее: навеску почвы в 5-30 г взбалтывают в течение 10 минут с 50-100 мл стерильной воды, а затем отстаивают. Надосадочную жидкость сливают, доводят по объему до 1-го литра стерильным физиологическим раствором; 0,5 л равными порциями фильтруют через 4 мембранных фильтра без прогревания, а вторые 0,5 л в колбах предварительно прогревают при температуре 65-70°С в течение 30 минут или при температуре 85°С в течение 15 – 20 минут и также фильтруют через 4 мембранных фильтра. Для проведения люминесцентно-серологического анализа 2 фильтра засевают на чашки с 0,7% МПА путем накладывания мембранного фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали почвенную взвесь, а с остальных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, для чего на поверхность наносят 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для введения белым мышам (тест капсулообразования in vivo) и исследования люминесцентно-серологическим методом.

Аналогично исследуются и фильтры, через которые профильтровывали прогретую надосадочную жидкость.

Для уничтожения вегетативных форм микроорганизмов (вместо прогревания загрязненного материала) к почвенной взвеси добавляют кристаллическую мочевину сизбытком, чтобы на дне появился небольшой нерастворившийся осадок. Ставят или в водяную баню при 37°С на 5-10 минут, или в термостат на 30 минут. Осадок после обработки мочевиной высевают в 3-5 чашек с агаром. Через сутки появляется рост споровых форм аэробных микроорганизмов, которые подлежат дальнейшему изучению.

Предварительный положительный ответ (сигнальный) дается на основании специфического свечения материала в люминесцентно-серо-логическом анализе, капсулообразования in vivo и in vitro.

15.2. Микроскопическое (предварительное) исследование.

Световая микроскопия. Из поступившего материала готовят несколько мазков, которые подсушивают на воздухе и фиксируют в спирте с добавлением 3% перекиси водорода не более 30 мин. Окрашивают по Граму. В окрашенных мазках сибиреязвенный микроб представляет собой грамположительные палочки, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях форма сибирской язвы может быть не характерной (короткие, толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки с вздутием посередине или на конце, возможно наличие «теней» микробов).

15.3. Люминесцентная микроскопия.

Мазки для люминесцентной микроскопии подсушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте с 3% перекисью водорода в течение 30 мин. На высохшие фиксированные мазки наносят в рабочих разведениях, указанных на этикетке соответствующие диагностические сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины (люминесцентная споровая сыворотка, соматическая, капсульно-соматическая) в зависимости от исследуемого материала.

Мазки с нанесенными на них люминесцирующими иммуноглобулинами помещают во влажную камеру - чашку Петри или эксикатор с увлажненной 0,9% раствором хлорида натрия или дистиллированной водой фильтровальной бумагой или комочком ваты, выдерживают для окрашивания при 37°С в течение 20 мин. Затем их тщательно промывают два раза по 5 мин в 0,9% растворе хлорида натрия, затем в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Препараты покрывают покровными стеклами или просматривают немедленно без покровных стекол. Мазки микроскопируют в люминесцентном микроскопе с сис­темой подобранных светофильтров, под иммерсионным объективом.

Споры и вегетативные клетки сибиреязвенного микроба, окрашенные люминесцирующими иммуноглобулинами, дают яркое свечение периферии клеток, имеющих характерную для данного вида морфологию. Такое свечение называется специфическим, в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным неярким свечением всей поверхности клеток.

15.4. Посев на питательные среды.

Подготовленный материал для исследования засевают на чашки Петри с питательным агаром. Используют МПА, агар Хоттингера (рН 7,2-7,5) или дифференциально-диагностическую среду. Для засева одной пробы желательно использовать 5-10 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Если материал значительно загрязнен посторонней микрофлорой делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и мясопептонный бульон (далее – МПБ). Посевы помешают в термостат при 37°С на 18-20 часов.

На следующий день посевы просматривают не только визуально, но и под малым увеличением микроскопа. На чашках, кроме сибиреязвенного микроба, наблюдается рост и других спорообразующих сапрофитовморфологически трудно отличимых от В. anthracis. Для сибиреязвенного микроба характерно образование крупных, шероховатых, матовых колоний, край которых напоминает локоны волос, состоящих из сплетений длинных нитей микробов, получивших название «головы медузы», «львиной гривы». Колонии В. anthracis вырастают и трудно снимаются петлей с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для идентификации с питательного агара отбирают не менее 10 шероховатых, при отсутствии такого количества - все шероховатые колонии.

Из всех отобранных колоний делают мазки на 2 или более предметных стеклах. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами - по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной соматической люминесцентной сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками - специфическое свечение на 4+ или 3+. Для дальнейшей идентификации отбирают только те колонии, которые состоят из характерных для сибиреяз­венного микроба палочек. При возможности из этих же колоний делают посевы на дифференциально-диагностическую среду или кровяной агар, на МПБ и на косойагар. На чашки с питательным агаром посев производят секторами (6-8 колоний на одну чашку). Посевы помещают в термостат на 18-20 часов, после чего проводят учет и отбор для дальнейшей идентификации по полной схеме лабораторного исследования. Отбирают те колонии, которые при росте на кровяном агаре не дают гемолиза бараньих эритроцитов, формируют характерный «комочек ваты» на дне пробирки при выращивании на МПБ.

15.6. Биологическая проба.

Для постановки биологической пробы используют белых беспородных мышей или морских свинок, иногда кроликов породы «шиншила» (для определения вирулентности атипичных сибиреязвенных штаммов). Исследуемый материал, подготовленный для исследования, суспендируется в небольшом объеме 0,9 % раствора хлорида натрия и вводится подкожно во внутреннюю поверхность бедра 2 мышам в объеме 0,2-0,5 мл или 2 морским свинкам в объеме 0,5-1,0 мл. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 суток, иногда позже. Павших животных вскрывают, делают мазки-отпечатки из тканей и органов, а также посевы на МПА или агар Хоттингера. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3 % перекисью водорода в течение 30 мин, а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синькой. В мазках при микроскопиисибиреязвенные бациллы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой, зачастую сливающуюся вокруг групп микробов. Для обнаружения капсул окрашивают одним из методов (по Ребигеру, Михину, Романовскому-Гимза). Лучшей краской является раствор Ребигера, который одновременно фиксирует и красит. В краске нефиксированный или фиксированный мазок выдерживают 15-20 секунд, затем промывают водой и высушивают. Нефиксированный окрашенный мазок по Ребигеру нельзя считать полностью обезвреженным, поэтому после просмотра его следует опустить в 6% раствор перекиси водорода. В мазках из свежего патологического материала капсула вокруг микроба окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет, тело микробной клетки - в темно-фиолетовый.

В посевах при просмотре чашек вырастают крупные шероховатые колонии с бахромчатой периферией. При вскрытии биопробных животных, павших от сибирской язвы, отмечают характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки на месте введения материала, гиперемию внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь.

15.7. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании следующих признаков:

для сибиреязвенного микроба характерны следующие морфологические формы: споры, вегетативные палочки и капсульные формы. Во всех случаях при приготовлении мазков обращают внимание на их фиксацию в мазках с добавлением 3 % перекиси водорода и окраску соответствующую форме возбудителя. Универсальной краской является раствор Ребигера, при окраске которым четко видны споры, розовая капсула и синие палочки. При окраске мазков сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками можно увидеть не только характерную морфологию микроба, но и определить специфичность, что существенным образом ускоряет проведение лабораторного анализа;

характерная морфология выросших на питательном агаре коло­ний. При использовании МПА, агара Хоттингера или дифференциаль­но-диагностической среды колонии сибиреязвенного микроба отлича­ются от колоний спорообразующих сапрофитов меньшими размерами, большей шероховатостью и более выраженными локонами по перифе­рии. Следует всегда обращать внимание, как колония берется петлей. Если масса микробов трудно отбирается бактериологической петлей, это свидетельствует в пользу сибиреязвенного микроба;

характер роста на МПБ. Некоторые представители спорообразующих сапрофитов могут расти на бульоне аналогично сибиреязвен­ному микробу. Однако при встряхивании пробирки сапрофиты легко мутят бульон, в то время как сибиреязвенный микроб дает комочек, трудно разбивающийся при встряхивании;

при использовании дифференциально-диагностической среды учитываются одновременно два важных диагностических признака - харак­тер выросших колоний и тест на щелочную фосфатазу;

тест с сибиреязвенным бактериофагом. Сибиреязвенный микроб лизируется сибиреязвенными фагами («Гамма», К и другими). Пробу с фагом ставят следующим образом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера или МПА перед постановкой пробы подсушивают в термостате. Расчерчивают дно чашки снаружи на квадраты со стороной 2 см. Бактериологической петлей или пипеткой на каждый квадрат наносят каплю 5-6-часовой бульонной культуры сибиреязвенного микроба. Чашку с приоткрытой крышкой подсушивают 30 минут в термостате, а затем в центр подсохшей капли наносят петлей каплю цельного сибиреязвенного бактериофага. Результаты учитывают через 5-6 часов инкубации чашек при 37⁰С, просматривая их под малым увеличением микроскопа. В более поздние сроки через 12-24 часа просматривают чашки невооруженным глазом. В случае положительного результата на месте нанесе­ния капли бактериофага наблюдается полный или частичный лизис ко­лоний в виде «бляшек»;

при вскрытии биопробных животных, которым введена исследуе­мая культура, делают мазки из перитониального экссудата и крови сердца и мазки-отпечатки из органов. Мазки фиксируют и окрашивают по Ребигеру или метиленовой синькой. В мазках от животных микробы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окруже­ны розовой капсулой. Способность к капсулообразованию in vivo из всех представителей рода Bacillus присуща только возбудителю сибир­ской язвы. Встречающиеся в природе атипичные штаммы, не образующие капсулу, но по другим тестам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований;

тест «жемчужного ожерелья». Перед постановкой пробы осту­женный до 45°С 2 % питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробир­ки. В первую добавляют пенициллин из расчета 0,5 ед/мл, вторую -0,05 ед/мл, третья - без антибиотика остается контрольной. Содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри. После застывания среды дно чашек снаружи размечают на квадраты или кружки, на которых пишут номера анализа. На обозначенные участки наносят по одной кап­ле изучаемых 3-6-часовых бульонных культур. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Посевы инкубируют при 37°С. Не позже 3 часов просматривают рост с сухой (х40) и иммерсионной (х90) фазовоконтрастными системами под микроскопом, предварительно накрыв каждый отмеченный участок покровным стеклом. На стекле, содержащем пенициллин, видны шарообразные формы бактериальных клеток, расположенных в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. Спорообразующие сапрофиты, как правило, устойчивые к пенициллину, образуют на среде с пенициллином обычные формы микробов. В контрольной чашке без пенициллина сибиреязвенный микроб формирует длинные цепи палочек;

тест на подвижность. Сибиреязвенный микроб неподвижен, чем отличается от большинства спорообразующих сапрофитов. Подвижность устанавливают в «висячей капле» или при посеве уколом в полужидкий агар. В полужидком агаре рост сибиреязвенного микроба наблюдается только по ходу укола. Посевы выдерживают в термостате при 37° С 18-20 часов;

гемолиз эритроцитов барана. Для проведения этого теста готовят кровяной агар - МПА или агар Хоттингера с 3-5 % дефибринированной крови барана (рН 7,2-7,3). Выдерживают в термостате при 37°С в течение 18-20 часов, после чего учитывают резуль­тат. В эти сроки сибиреязвенный микроб не дает гемолиза эритроцитов барана в отличие от родственных спорообразующих сапрофитов, обра­зующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний;

тест на лецитиназу. Наличие или отсутствие лецитиназной активности определяют в жидкой желточной среде или на агаре Хоттин­гера, в который добавлен стерильно желток куриного яйца. В пробирки с 5 мл жидкой желточной среды засевают петлей суточную культуру и инкубируют в термостате при 37°С. Возбудитель сибирской язвы, как правило, в течение нескольких суток инкубирования не свертывает жел­ток, в то время как представители спорообразующих сапрофитов свер­тывают желток уже в первые сутки. На плотной питательной среде с желтком сибиреязвенный микроб растет, не образуя вокруг колоний мутной белой зоны. Вокруг колоний большинства сапрофитов, выраба­тывающих активную лецитиназу, просматривается широкая мутно-белая зон

ПРИЛОЖЕНИЕ № 2

Схема санитарно-вирусологического исследования почвы.