Тема:«Микробиологическая диагностика риккетсиозов, хламидиозов, микоплазмов».

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению морфологических, биологических свойств и таксономии риккетсий,хламидий, микоплазм и методов микробиологической диагностики и заболеваний, вызываемых ими.

2. Овладеть техникой и методикой:

- проведения серодиагностики риккетсиозов;

- учета РАР, РСК, РНГА, выписки ответа и заключения по результатам;

3. Изучить правила забора исследуемого материала при микоплазмозах и хламидиозах, его подготовку к исследованию

4. Изучить питательные среды, применяемые для культивирования микоплазм.

5. Изучить серологические методы диагностики микоплазмозов.

6. Изучить методы микробиологической диагностики хламидиозов.

7. Овладеть методикой и техникой посева исследуемого материала при микоплазмозах.

8.Овладеть методикой и техникой постановки РНГА при серологической диагностике хламидиозов.

IIСамостоятельная работа

Задание 1.

Изучите морфологию и тинкториальные свойства риккетсий путем микроскопии музейных препаратов и по таблицам. Зарисуйте и подпишите.

Задание 2.

Поставьте РАР с сывороткой обследуемого и антигеном из риккетсий Провачека для РА в объеме 0,4 мл.

1.Схема разведения сыворотки обследуемого:

Примечание:

▪разведения сыворотки делают в отдельном ряду обычных пробирок и разливают по 0,2 мл в агглютинационные пробирки, тщательно вымытые простерилизованные;

▪необходимо учитывать, что после добавления антигена разведения сыворотки удваиваются и, следовательно, разведения надлежит делать соответственно в 2 раза меньшими.

2. Схема постановки РАР:

Примечание: каждая пробирка тщательно встряхивается. Пробирки ставятся в термостат при 37⁰С до следующего дня и результат учитывается через 2 часа дополнительного пребывания при комнатной температуре.

Учет результатов производится по осадку – без встряхивания пробирок – по схеме:

(++++) – полное просветление жидкости над осадком, при компактном осадке на дне пробирки;

(+++) - полное просветление жидкости над осадком, значительный осадок на дне пробирки;

(++) – мутная жидкость при небольшом зернистом осадке на дне и стенках пробирки;

(+) – небольшая зернистая взвесь;

(-) – гомогенная взвесь.

▪Контроль антигена – взвесь риккетсий должна быть полностью гомогенной.

▪Контроль сыворотки – жидкость должна быть прозрачной без хлопьев.

▪Реакция считается положительной при наличии агглютинации в конечных разведениях обозначаемой не менее чем на (++).

3. Проведите учет результатов реакций и сделайте заключение.

Заключение:

Задание 3.

Закрепите знания по изучению правил постановки РСК с сухим антигеном из риккетсий Провачека и подготовки ингредиентов:

1) РСК ставится по общепринятой: схеме в общем объеме 1,25мл при условии точного оттитровывания рабочей дозы комплемента.

2) Испытуемые сыворотки (инактивированные при +56⁰С 3Омин) разводятся ИХН от 1:20 до 1: 2560 (8 пробирок опытных ).

3) Сухой антиген растворяется перед постановкой опыта в том объеме ИХН, который указан на этикетке ампулы, в таком виде применяется в реакции разводить не надо).

4) В реакции используют только сухой комплемент. Исходным его разведением является разведение 1:10. Титрование комплемента для расчета его рабочей дозы проводится по общепринятой схеме.

5) Связывание (т.е. I фазу) можно производить как на холоде (при +4⁰С на протяжении 18 часов) – в холодильнике, так при +37⁰С на протяжении I часа - в термостате.

6) Гемолитическая система состоит из смеси равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сывороток в тройном титре (т.е. взятой в разведении в 3 раза сильнее указанного на этикетке ампулы).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ:

если, например, титр сыворотки 1:1200, то нужно приготовить разведение 1:400, т.е. к 1 мл гемолитической сыворотки прибавить 399 мл ИХН (0,1мл сыворотки+39,9мл ИХН), таким образом, получаем разведение гемолитической сыворотки в тройном титре.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ 3% ВЗВЕСИ ЭРИТРОЦИТОВ БАРАНА:

консервированную кровь (2 ампулы по 5 мл) центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 мин.; надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют до первоначального объема (5 мл) ИXH; взвесь эритроцитов центрифугируют при том же режиме. Отмывание эритроцитов проводят 2-5 раза, при этом последняя порция надосадочной жидкости должна оставаться бесцветной, 3% взвесь эритроцитов получают суспензируя 3 мл осадка эритроцитов в 97 мл ИХН 3% взвесь эритроцитов годна в течение дня.

7) Все компоненты, участвующие в РСК, берутся в равных объемах. Для определения объема I компонента необходимо общий объем реакции разделить на 5 (т.к. в РСК участвует 5 специфических компонентов).

8) Необходимо строго соблюдать последовательность внесения ингредиентов реакции, т.е. сначала проводят 1 фазу реакции, а затем – II фазу.

Изучите схему титрования комплемента для постановки РСК с антигеном из риккетсий Провачека.

ПРИМЕЧАНИЕ:

I. Так как титрование комплемента ведется в отсутствие антитела и антигена, то объем жидкости в каждой пробирке доводится до 0,75 мл, прибавлением ИХН (до внесения гемолитической системы).

2. За одну единицу комплемента принимается количество его, вызывающее полный гемолиз (в нашем примере 0,06 мл разведения комплемента 1:10), а за одну такую полную единицу принимается количество во второй пробирке с полным гемолизом (в нашем примере 0,07 мл разведения комплемента 1:10).

3. Если связывание (т.е. I фаза РСК) ведется, на холоду, то в качестве «рабочей дозы» берется в основной опыт 2 полных единицы комплемента (т.е. 0,14 мл разведения комплемента 1:10).

Если связывание ведется при +37⁰С, то «рабочая доза» комплемента берется в основной опыт в количестве 1 полной единицы (т.е. 0,07 мл разведения комплемента 1:10).

РАССЧЕТ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА КОМПЛЕМЕНТА:

а) РСК будем проводить при +37С, значит «рабочая доза» комплемента = I полной единице комплемента, т.е. 0,07 мл разведения комплемента 1:10;

б) всего в опыте участвует 12 пробирок (8 опытных и 4 контрольных);

в) 0,07 мл х 12 = 0,84 мл комплемента 1:10 нужно взять на все пробирки (т.е. на всю РСК);

г) 0,25 мл - 0,07 мл = 0,18 мл ИХН нужно добавить в одну пробирку, чтобы объем комплемента составил 0,25 мл;

д) 0,18 мл х 12 = 2,76 мл ИХН нужно добавить во все пробирки;

е) «рабочая доза» комплемента = 0,84 мл комплемента 1:10 + 2,76 мл ИХН ≈ 1 мл комплемента 1:10 + 3 мл ИХН (т.е. округляем) - это и будет общий объем комплемента на всю РСК.

Задание 4

1. Поставьте РСК с антигеном из риккетсий Провачека (используется для серодиагностики сыпного тифа), в объеме 1,25 мл проведите учет результатов и сделайте заключение.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РСК

Примечание:

1) Задержка гемолиза отмечается знаком «+» и свидетельствует о положительном результате реакции (PСK +).

2) Гемолиз отмечается «-» и свидетельствует об отрицательном результате реакции ( PСK - ).

3) Учет результатов PСK производится по четырехкрестной системе, Положительной реакция считается при наличии задержки гемолиза не менее, чем на ++. Условно-диагностическим титром является положительный результат в разведении 1:160 и выше. Но и при таких показателях реакция положительная оценка дается только с учетом нарастания титра антител при повторном исследовании.

РЕЗУЛЬТАТ: «Реакция связывания комплемента с антигеном из риккетсий Провачека ____________________________________________________________.»

Заключение: «Результат реакции позволяет предположить наличие у обследуемого ___________________________________________________».

Задание 5.

Изучите поставку РНГА с сыпно-тифозным эритроцитарным диагностикумом.

Алгоритм постановки РНГА

1. РНГА ставят в полистероловых пластинах или пробирках в которые разливают по 0,4мл 2-х кратные испытуемой сыворотки (1:125 до 1:64000) на 0,9% ИХН (готовится заранее, по аналогии задания № 2).

2. В каждую лунку (пробирку) добавляют по 0,1 мл тщательно перемешанного диагностикума.

3. Постановку реакции сопровождают следующие контроли:

Ø испытуемой сыворотки на отсутствие не специфических гемагглютининов: к 0,4 мл сыворотки в разведении 1:125 добавляют 0,1 мл взвеси контрольных не сенсибилизирован-ных формализированных эритроцитов;

Ø отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума и контрольных эритроцитов: в две лунки вносят по 0,1 мл диагностикума и в две лунки по 0,1 мл взвеси контрольных эритроцитов, после чего во все лунки добавляют по 0,4 мл 0,85% ИХН;

Ø специфической активностью диагностикума: по 0,1мл диагностикума добавляют к 0,4 мл 2-х кратных разведений иммунной сыворотки (с 1:125 до 1-2 разведений, превышающих ее титр указанный на этикетке).

4. Содержимое лунок опытных и контрольных рядов перемешивают интенсивным покачиванием до получения гомогенной взвеси и оставляют при комнатной температуре.

Учет результатов. Проводят через 13-15 часов невооруженным глазом по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов (предварительный учет возможен через 3-4 часа).

Ø При положительной реакции обозначаемой (+) на дне лунки образуется широкий зернистый осадок из склеившихся эритроцитов в виде перевернутого зонтика.

Ø При отрицательной реакции обозначаемой (-), эритроциты оседают в центре лунки, образуя маленький диск с ровными краями.

Результаты реакции учитывают при условии:

Ø испытуемая сыворотка не агглютинирует контрольные эритроциты;

Ø отсутствует спонтанная агглютинация диагностикума и контрольных эритроцитов;

Ø иммунная сыворотка агглютинирует диагностикум до ее титра указанного на этикетке.

При заболевании сыпным тифом РНГА становится положительной при разведении сыворотки 1:125 – 1:250 на 5-7 день болезни, максимальные титры (1:1000 – 1:64000) определяются в первые две недели заболевания.

В связи с этим рекомендуется исследовать парные сыворотки, полученные на 5-7 и 12-15 дни заболевания.

Диагностическим титром является положительная реакция сыворотки с разведения 1:1000 и выше.

Задание 5.

Изучите правила забора исследуемого материала и его подготовку к анализу при микоплазмозах ( «Методы лабораторной диагностики урогенитальных микоплазмозов» от 05.04.1999 г., см. Приложение №1).

Задание 6.

Изучите алгоритмы приготовления питательных сред, применяемых для культивирования микоплазм.

Алгоритм

приготовления жидкой питательной среды

для культивирования U. urealyticum и М. hominis.

В стерильной колбе или флаконе смешивают с соблюдением асептики следующие компоненты:

- 0,5% р-р хлорида натрия - 58 мл.

- гидролизат бычьего сердца – 6 мл.

- гидролизат казеина для внутривенных вливаний – 6 мл.

- лошадиная сыворотка – 20 мл.

- 25% экстракт дрожжей – 5 мл.

- 2% р-р L – цистеина – 1 мл.

-10% р-р L – аргинина – 5 мл.

- 10% р-р мочевины – 1 мл.

- 0,2% р-р фенолового красного – 1 мл.

- пенициллин – 100000 ЕД (1000 ЕД/мл).

Стерилизуют в автоклаве при t.110-112⁰С 10-15 мин.

Цвет среды должен получиться желтым (охряно-желтым), что соответствует рН 6,0-6,3. При красной или оранжевой окраске рН поправляют 1N раствором хлористоводородной кислоты, добавляя последнюю по каплям и следя, чтобы желтый цвет появился от одной капли кислоты. Вместо фенолового красного можно использовать индикатор бромтимоловый синий. Цвет среды в таком случае должен быть лимонно-желтым. При любом варианте жидкой питательной среды важно, чтобы она была прозрачной. Для предотвращения возможного роста дрожжеподобных или плесневых грибов в состав питательной среды можно вносить нистатин в конечной концентрации 15-20 ЕД/мл или амфотерицин В 2 ЕД/мл.

Приготовленную среду желательно использовать в течение 2-х недель, допускается ее хранение в холодильнике до 1 месяца. Более длительный срок ее хранения требует замораживания среды при – 20⁰С. Флакон с готовой питательной средой должен быть закрыт стерильной резиновой пробкой для предотвращения испарения воды.

Готовую питательную среду разливают по стерильным пробиркам с ватно-марлевыми пробками в объеме 1,5-2 мл, проводят контроль стерильности, помещая по 1-2 пробирки со средой на 2 суток в термостат при 37⁰С. Жидкую питательную среду обычно используют и в качестве субстрата для разведения клинического материала при посеве на плотную среду. В последнем случае жидкую среду разливают, например, по 2 мл в стерильные пенициллиновые флаконы с 2-3 стеклянными бусинами (для лучшей гомогенизации исследуемого материала).

Алгоритм

приготовления плотной питательной среды для культивирования U. urealyticum и М. hominis.

В термоустойчивую колбу помещают по 18 мл гидролизата бычьего сердца и гидролизата казеина (или 36 мл гидролизата бычьего сердца). 1,2 г хлорида натрия, 0,6 г однозамещенного фосфата калия (КН₂РО₄), 0,03г сульфата марганца (МnSO₄ или 1 мл 3% раствора), 3,8 г агара и добавляют 200мл дистиллированной воды. Смесь размешивают, проверяют рН, которая должна быть в пределах 6,0-6,5 и оставляют на 10-20 минут для набухания агара. Затем добавляют еще 100 мл дистиллированной воды и смесь кипятят 10 минут до полного ее растворения. Горячую основу фильтруют через ватно-марлевый фильтр, быстро разливают в колбы и автоклавируют при 121⁰С (1 атм) в течение 20 минут.

Простерилизованную основу хранят в холодильнике при 4⁰С несколько месяцев, при этом желательно, чтобы флаконы были закрыты стерильными резиновыми пробками для предотвращения испарения воды.

Перед использованием основу расплавляют на кипящей водяной бане, охлаждают до 56⁰С и обогащают с соблюдением асептики следующими компонентами:

- 25% дрожжевой экстракт -5 мл,

- лошадиная сыворотка – 20 мл,

- 10% р-р L – аргинина – 5 мл,

- 2% р-р L – цистеина – 1 мл,

- 10% р-р мочевины – 1 мл,

- пенициллин – 250000 ЕД (2500 ЕД/мл).

В состав среды можно вносить нистатин в конечной концентрации 15-20 ЕД/мл или амфотерицин В2 ЕД/мл, что предотвращает рост дрожжеподобных грибов. Лучше всего обогащающие добавки вносить предварительно прогретыми в термостате или инактиваторе.

Подготовленную питательную среду быстро разливают по маленьким стерильным чашкам Петри. При отсутствии последних можно использовать стандартные чашки Петри, дно которых в последующем нужно расчертить на 4-6 секторов. После застывания агара чашки со средами оставляют на рабочем месте дном вверх на ночь. Затем чашки помещают в холодильник при 4⁰С, желательно завернутыми в полиэтиленовые пакеты для предупреждения потери влаги. Хранят не более 1 месяца. На просвет среда должна быть прозрачной, допускается только легкая ее опалесценция. Мутная среда для работы не годится.

Контроль стерильности проводится путем помещения 1-2 чашек со средой в термостат при 35-37⁰С на 24-48 часов. Наличие бактериальной контаминации или роста плесневых грибов указывают на непригодность среды.

Задание 7.

1. Изучите алгоритм культуральной диагностики урогенитальных микоплазмозов.

В связи с отсутствием во всем семействе микоплазм четких морфологических характеристик, наличием у них выраженного полиморфизма, а также мелких размеров, диагностика микоплазма-инфекций при прямой микроскопии окрашенных препаратов практически исключена.

Общепринятымдля обнаружения этой группы микроорганизмов являются культуральные методы исследования.

Наиболее оптимальной и часто практикуемой основой для роста микоплазм признана среда, в состав которой входят гидролизат (триптический перевар) сердца крупного рогатого скота, лошадиная сыворотка и дрожжевой экстракт. Для оптимизации роста в среды вносятся обогащающие добавки, прежде всего аминокислоты L-цистеин и L-аргинин. Поскольку состав микоплазменных сред вполне подходит и для развития истинных бактерий, для подавления последних в среды добавляют пенициллин в большой концентрации (от 1000 до 2500 ЕД/мл), иногда другие антибиотики, к которым микоплазмы резистентны.

Генитальные микоплазмы могут культивироваться как на жидких, так и на плотных питательных средах. При бактериологической диагностике применяют как правило, и первый, и второй варианты.

Посев клинического материала на жидкие питательные среды используется как предварительный тест на ферменты уреазу (для U. urealyticum) и аргиназу (для М. hominis). Под влиянием уреазы происходит расщепление мочевины с образованием аммиака, что приводит к защелачиванию жидкой питательной среды и изменению цвета индикатора в течение 18-24 часов. Фермент аргиназа, продуцируемый М. hominis, разлагает аминокислоту аргинин., что также сопровождается повышением рН среды. Последнее происходит медленнее, чем при разложении мочевины уреазой, и изменение цвета индикатора наблюдается в среднем через 48 часов. Для исключения ложноположительных результатов, например, проявлений уреазной или аргиназной активности некоторыми бактериями, а также дифференцирования уреаплазм и «классических» микоплазм. производят одновременный посев клинического материала или субпассаж выделенной культуры с жидкой питательной среды на плотную с целью последующей идентификации выросших микроколоний возбудителей, которые имеют характерную для каждого вида морфологию.

При прямом посеве клинического материала на плотные питательные среды производят подсчет выросших микроколоний для определения этиологически значимой концентрации микоплазм.

В последние годы появились специальные тест-системы, пользуясь которыми можно одноэтапно определять на жидкой питательной среде не только того или иного микоплазменного возбудителя, но и его концентрацию в исследуемом клиническом материале (например, тест-система «Mycoplasma IST» производства «bioMerieux») или «Mycoplasma DUO» производства Sanofi Pateur.

2. Проведите посев исследуемого материала (мочи) на «плотную питательную среду» для культивирования микоплазм.

Алгоритм посева.

1. Посев на плотную среду осуществляется путем нанесения на ее поверхность (предварительно расчерченную на 3 сектора) с помощью стерильной пастеровской пипетки 3-х капель гомогенизированного материала, таким образом, чтобы эти капли не соприкасались друг с другом.

2.Не допускается растирание засеваемого материала по поверхности среды!

3. Засеянные чашки Петри оставляют на 5 минут при комнатной температуре с целью проникновения жидкости вглубь среды. Инкубирование проводят в увлажненном эксикаторе с зажженной свечой при 37⁰С, чашки Петри должны быть перевернутыми вверх дном.

4. Учет результатов.

·Первый просмотр засеянных жидких и плотных сред проводят через 24-48 ч. Изменение окраски жидкой среды с желтой на красную (при использовании индикатора бромтимолового синего с желтой на зеленую) при сохранении полной прозрачности среды свидетельствует о вероятности положительной реакции на уреазу, характерной для U. urealyticum. Если изменение цвета сопровождается помутнением среды, это указывает на бактериальную контаминацию, не подавляемую пенициллином. В последнем случае тест не подлежит учету. Однако помутнение может быть связано и с избытком засеянного клинического материала, поэтому требуется каждый раз внимательно оценивать содержимое пробирки.

·Следует помнить, что изменение окраски жидкой среды на вторые сутки возможно иногда и при росте возбудителя М. hominis, если последний присутствует в клиническом материале в высокой концентрации.

·Возбудитель U. urealyticum на вторые сутки дает на поверхности плотной среды микроколонии, различимые под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Колонии уреаплазм могут иметь как округлую, так и неправильную форму, края их часто зубчатые, поверхность слегка сморщенная, при росте они полностью погружаются в агар. Такую форму колоний в микробиологии называют «морские ежи». Размеры микроколоний колеблются от 10 до 50 мкм. В присутствии солей марганца колонии окрашиваются в различные оттенки коричневого цвета вплоть до черного, что делает их хорошо заметными на прозрачном фоне агара.

·Изменение окраски жидкой питательной среды при росте возбудителя М. hominis характерно на третьи сутки (через 48 часов инкубации). Цвет среды в присутствии индикатора фенолового красного становится красным (пурпурным), в присутствии бромтимолового синего – зеленым или зелено-синим. Характерно сохранение прозрачности среды, иногда возможна легкая муть. Помутнение среды чаще всего свидетельствует о бактериальной контаминации, не подавляемой пенициллином, дающей уреазную или аргиназную активность.

·Рост М. hominis на плотной среде характеризуется образованием колоний округлой формы с характерным уплотненным центром, из-за чего их сравнивают с «яичницей-глазуньей». Размеры микроколоний составляют 100-300 мкм, в присутствии сульфата марганца они остаются прозрачными. Рост колоний поверхностный, лишь центральная часть слегка погружается в агар.

·Одновременный рост М. hominis и U. urealyticum сопровождается изменением окраски жидкой среды в течение 24-48 часов и дает 2 типа микроколоний на поверхности плотной питательной среды.

·Отсутствие изменения окраски жидкой среды в течение 48часов и роста микроколоний на плотной среде в течение 72 часов дают основание считать результат исследования на микоплазмы отрицательным.

Интерпретация результатов (индикатор феноловый красный)

Подсчет колоний

Показатель 10⁴ КОЕ/мл и более является «патологическим» (этиологически значимым) и указывает на проявление патогенных свойств у микоплазменных возбудителей и их значении в развитии заболевания. (При исследовании мочи этиологически значимыми являются показатели, начиная с 10³ КОЕ/мл и более).

Примеры лабораторного заключения: «в посеве - рост U. urealyticum в концентрации 10⁴ КОЕ /мл, "в посеве – рост М. hominis в концентрации 10³ КОЕ/мл».

Примечание:иногда при культуральной диагностике генитальных микоплазмов возможны некоторые «нестандартные» варианты.

Задание 8.

Изучите серологические методы диагностики микоплазмозов.

1. Определение микоплазменных антител.

·Несмотря на то, что серологический метод достаточно давно используется в диагностике респираторных микоплазмозов, до настоящего времени он не находит широкого применения в выявлении микоплазменных инфекций. Это связано с множеством причин и прежде всего, с недостаточной изученностью иммунологических изменений под влиянием микоплазм, вызывающих поражение мочеполовых путей.

·У лиц, инфицированных микоплазмами, появляются антитела, которые могут быть выявлены в различных серологических реакциях: РСК, РНГА, ИФА. Однако, в отличие от поражений респираторного тракта, при микоплазменных инфекциях мочеполовых путей воспалительный процесс захватывает значительно меньшую анатомическую сферу, особенно у мужчин. Это сопровождается относительно слабым раздражением иммунной системы и, следовательно, слабой выработкой антител.

·При послеродовых микоплазменных осложнениях - послеродовой бактериемии, сепсисе, осложнениях после абортов. При хронических, особенно локальных процессах, отчетливой сероконверсии не наблюдается даже в отношении аутоштаммов.

·Распространение воспалительного процесса на внутренние репродуктивные органы (полость матки, маточные трубы, яичники) обычно ведет к образованию антимикоплазменных антител, что облегчает постановку этиологического диагноза. Показанием для серодиагностики является бесплодие, невынашивание беременности, возникновение в родах хориоамнионита и лихорадочных послеродовых заболеваний.

·В настоящее время из общедоступных диагностикумов является «МикогомоСкрин (G+M)» – выявление антител классов lg M и lg G методом ИФА против М. hominis. Детальное описание методики и интерпретация результатов изложены в прилагаемой к тест-системе инструкции.

Четырехкратное нарастание титра антител в динамике заболевания свидетельствует об инфекционном процессе, обусловленном М. hominis.

2. Определение антигенов микоплазм.

Выявление антигенов микоплазм можно проводить с помощью меченых антител в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) или в иммуноферментном анализе (ИФА). В настоящее время этот метод не получил широкого распространения.

·Для постановки РИФ используют специфическую антисыворотку, конъюгированную с флюорохромом. Из стандартных доступных диагностикумов можно отметить тест-систему «УреаСлайд» для выявления антигенов U. urealyticumметодом прямой иммунофлюоресценции и аналогичную тест-систему «МикоСлайд» для выявления антигенов М. hominisпроизводства НПФ «ЛАБдиагностика» (Россия).

·В исследуемых микропрепаратах микоплазмы выявляются в виде полиморфных структур (зерен, гранул, коккобактерий и т.д.), имеющих ярко-зеленое свечение, на поверхности эпителиальных клеток, в обзацах спермы – на сперматозоидах, а также свободно. Неспецифическая бактериальная микрофлора окрашивается в оранжевый цвет, клетки эпителия, лейкоциты, сперматозоиды – в оранжевый и красно-бурый. Качество мазка определяется, прежде всего, наличием клетоки клеточных элементов при минимальном количестве слизи, эритроцитов и пр. Необходимо отметить, что выявление антигенов микоплазм с помощью РИФ практикуется лишь как качественная реакция на присутствие инфекции и, в принципе, не позволяет определять этиологически значимое количество возбудителя.

Задание 9.

Изучите микробиологическую диагностику хламидиозов.

1.Материалом для исследования являются соскобы (но не мазки) с конъюнктивы, стенок мочеиспускательного канала, шеечного канала (и его отделяемое), содержимое бубонов, мокрота.

2. Материал микроскопируют применяя фазово-контрасную технику или окрашивают мазки по Романовскому-Гильзе. В мазках в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживаются включения – тельца Провачека-Хальберштедтера (см. цветной вкладыш к МР № 47).

3. Определяют антитела в сыворотке обследуемого в РИФ, РСК, РНГА,особую ценность представляет реакция ИФА, позволяющая выявить сывороточные lgM и lgC, позволяющие распознавать заболевания на начальных стадиях и в стадии обострения.

4. Применяют методы экспресс диагностики для определения антигена возбудителя (выявляют липополисахаридные антигены) в реакции ИФА, а также используют ПЦР.

5. Выделение С.trachomatis обычно не проводят, однако исследуемым материалом можно заражать культуру клеток человека или куриные эмбрионы.

Задание 10.

Поставьте РНГА с сывороткой обследуемого и диагностикумом эритроцитарным хламидийным.

Алгоритм постановки реакции.

1. Последовательные разведения исследуемой сыворотки готовят на формалинизированном ФСБР рН 7,3. Для этого в ряд лунок микропипеткой наливают по 0,05 мл формализированного ФСБР. В первую лунку вносят 0,05 мл исследуемой сыворотки, предварительно разведенной 1:20. После перемешивания пипеткой переносят 0,05 мл во вторую лунку, из второй – в третью и т.д. до разведения сыворотки 1:1280. Из последней лунки 0,05 мл р-ра выливают в дез. раствор.

2. В каждую лунку добавляют по 0,01 мл диагностикума эритроцитарного хламидийного, предварительно растворенного 1 мл дистиллированной воды и выдержанного в течение 1 часа при температуре 20⁰С.

3. Содержимое лунок тщательно перемешивают постукиванием по краям пластины до образования равномерной взвеси и оставляют при температуре 20⁰С – 4 часа.

4. Реакцию сопровождают следующие контроли:

·контроль диагностикума эритроцитарного хламидийного на отсутствие спонтанной агглютинации: в три лунки содержащие по 0,05 мл ФСБР, добавляют по 0,01 мл хламидийного диагностикума.

·положительный контроль: проведение РНГА с хламидийной сывороткой прилагаемой к препарату.

·постановка РНГА с диагностикумом эритроцитарным хламидийным контрольным и сывороткой обследуемого.

·Контроль диагностикума эритроцитарного хламидийного контрольного на отсутствие спонтанной агглютинации.

Учет результатов.

Учет результатов проводят визуально по степени агглютинации эритроцитов, по четырехкрестной системе:

++++ - агглютинировавшие эритроциты должны ровным слоем выстилать дно лунки, образуя по форме купол;

+++ - на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается широкое кольцо с тонким неровным «фестончатым» краем, представляющее собой неагглютинировавшие эритроциты;

++ - на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечаетсяменее широкое кольцо с более ровными краями, представляющее собой осадок неагглютинировавших эритроцитов;

+ - значительная часть эритроцитов не агглютинируется и оседает на дно лунки в виде кольца с четким краем, вместе с тем имеется небольшое количество агглютинировавших эритроцитов;

(-) - эритроциты оседают в центе лунки в виде диска или компактного кольца с четким краем, хлопья агглютинировавших эритроцитов отсутствуют.

Реакцию считают специфической в том случае, если:

·контроли 1, 3,4 – отрицательные, если исследуемая сыворотка реагирует с контрольным диагностикумом в равной степени, что и с диагностикумом эритроцитарным хламидийным, то реакция расценивается как неспецифическая.

·Диагностикум эритроцитарный хламидийный агглютинируется контрольной сывороткой до ее титра, указанного на этикетке.

За титр испытуемой сыворотки принимают ее наибольшее разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитарного диагностикума не менее, чем на +++. Диагностическим титром при однократном исследовании считают разведение сыворотки 1:80 и выше.

Результат:

Заключение:

Оценка___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение №1

Правила забора исследуемого материала

и его подготовка к анализу при микоплазмозах

Клиническим материалом для посева могут служить: отделяемое или соскобы слизистых уретры, цервикального канала, содержимое заднего свода влагалища (для беременных), свежевыпущенная моча, семенная жидкость, простатический сок, перитонеальная жидкость.

Взятие отделяемого или соскоба уретры производят с помощью гинекологической или ушной ложечки (Фолькмана), при этом стараются, чтобы в препарат не попала кровь. Иногда для взятия клинического материала у мужчин пользуются маленькими стерильными ватными тампонами, вводимыми на глубину 2-3 см вращающими движениями в уретру. Наружное отверстие уретры при этом рекомендуют обработать стерильным физиологическим раствором. Перед взятием материала обследуемым не рекомендуют мочиться в течение 2 часов.

У женщин обычно исследуют отделяемое цервикального канала, которое берется после предварительной очистки шейки матки от избыточной слизи стерильным ватным тампоном. Забор лучше всего проводить гинекологической ложечкой, бескровно соскабывая материал с глубины примерно 1 см. При обследовании беременных берут отделяемое заднего свода влагалища. Как и у мужчин, можно также для посева использовать отделяемое уретры, при этом женщинам рекомендуют проводить задержку мочеиспускания в течение не менее 2 часов.

При исследовании мочи используют для посева ее первую порцию, которую больной выпускает в стерильную пробирку. Полученную мочу центрифугируют при 1500-2000 об./мин. в течение 10-15 мин, осадок ресуспензируют в 2 мл стерильного физиологического раствора. Следует помнить, что «инфекционность» данного материала резко снижается при его охлаждении, поэтому посев необходимо произвести как можно быстрее. Аналогично готовят материал из перитониальной жидкости.

Исследуемая сперма или простатический сок перед посевом разводятся стерильным физраствором в соотношении 1:10. Используется только свежий клинический материал, так как хранение может резко сказаться на лабораторных результатах.

При посеве материал жидкая питательная среда не должна быть холодной. После холодильника ее выдерживают не менее 1 часа при комнатной температуре или подогревают в термостате в течение 15-20 минут. Клинический материал засеивают, опуская гинекологическую ложечку в прогретую среду и слегка ее ополаскивая. Жидкий материал засеивают в объеме 0,2 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат при 37⁰С. Плотная питательная среда также прогревается в термостате. Клинический материал перед посевом на плотную среду гомогенизируется в 2 мл жидкой среды путем многократного встряхивания.