Лекция

Тема: «КОРИНЕБАКТЕРИИ ДИФТЕРИИ»

План

1.Таксономия возбудителей дифтерии.

2. Морфология и биологические свойства.

Культивирование. Токсинообразование.

3. Источники инфекции. Механизм заражения.

Патогенез, клинические формы дифтерии.

4. Особенности иммунитета. Профилактика дифтерии.

Дифтерия.

Таксономия возбудителя дифтерии.

Возбудитель дифтерии – Corynebacterium diphtheriaе (coryna – булава, bacterium – палочка,diphthera – пленка) относится к роду Corynebacterium семейству Corynebacteriасeae,отделу Firmicutes. Открыл коринебактерии дифтерии Э. Клебс в 1883 г., а выделил в чистой культуре

Ф. Леффлер в 1884 г. (палочка Клебса – Леффлера).

Кроме патогенных для человека и животных вида С. diphtheriaе в род Corynebacterium входят:

1) коринебактерии, патогенные для растений;

2) непатогенные коринебактерии:

а) дифтероиды – С. xerosis, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis;

б) псевдодифтерийные (ложнодифтерийные, палочки Гоффмана) –

С. рseudodiphtheriticum (C.hoffmfni).

Биологические особенности возбудителя дифтерии, имеющие лабораторно-диагностическое значение.

Морфология.

Коринебактерии дифтерии представляют собой прямые, или слегка изогнутые, полиморфные палочки размером 1-8мкм в длину и 0,3 – 0,8 мкм в ширину, имеющие булавовидные утолщения на обоих концах или по ходу длины палочки (зерна Бабеша – Эрнста), т.е. зерна волютина.

При окраске по Леффлеру (щелочным метиленовым синим в течение 10 мин.) эти полюсные включения окрашиваются в фиолетовый (темно-синий) цвет, а цитоплазма палочек – в голубой.

При окраске мазков по Нейссеру – зерна Бабеша-Эрнста окрашиваются в коричневый, черный или темно-синий цвет, а цитоплазма палочек – в желтый цвет; при окраске пиоктонином включения окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а цитоплазма палочек – в светло- фиолетовый цвет.

По Граму коринебактерии равномерно окрашиваются в фиолетовый цвет, т.е. грам ⁺.

Спор и капсул не образуют, неподвижны. Благодаря разламывающему механизму деления их клетки в мазке располагаются под углом и образуют букву игрек, или римские V – Х, или принимают вид растопыренных пальцев.

Полиморфизм их проявляется в появлении ветвистых, нитевидных форм, кокковидных и дрожжеподобных образований.

В отличие от истинных палочек Леффлера дифтероидыи ложнодифтерийные палочки Гоффмана в мазках располагаются в виде частокола, а зерна волютина имеют на одном конце или совсем не имеют.

Культуральные свойства.

Коринебактерии дифтерии – факультативные анаэробы или аэробы; optim. t° = 37⁰C, границы роста 15° – 40⁰С; рН среды 7,2 – 7,6. Они не растут на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотки, а также теллурит калия.

На основании культуральных и ферментативных свойств С. diphthemaeподразделяются на 3 биовара: gravis, mitis, intermedius.

Первичные посевы материала при выделении коринебактерий дифтерии производят на пластинчатые элективные среды (в чашках Петри): кровяно-теллуритовый агар - КТА, среда Клауберга; сывороточный агар с теллуритом калия и цистином – «Т», среда Тинсдаля – Садыковой; кровяной агар 5 – 10%; 20% сывороточный агар, а также на дифференциально-диагностическую среду Бучина.

На этих средах С. diphtheriaе образуют колонии в зависимости от биовара; на среде Клауберга (через 24-48 часов):

var gravis- (грубый, шероховатый) формирует плотные сухие шероховатые (R – формы), розеткообразные колонии диаметром 1,5 – 2 мм, с волнистым краем серого или темно-серого (черного) цвета. Колонии хрупкие – при раздавливании петлей они крошатся на мелкие кусочки. Их можно также «двигать» петлей по поверхности агара без нарушения целостности. На средах с кровью не дают гемолиза.

var mitis (тонкий, гладкий)- образует серые матовые колонии диаметром 1,5 – 2 мм с ровным краем и гладкой поверхностью , блестящие (S – формы). Характерна вариабельность размеров колоний. Обычно на кровяном агаре имеют небольшую зону гемолиза.

var intermedius^, (промежуточный)– образует колонии RS – формы: мелкие, серые, прозрачные колонии диаметром 0,5 – 1 мм.

На среде Тинсдаля вокруг колоний всех биоваров образуется темно-коричневый ободок.

Кроме элективных сред первичные посевы материала можно производить надифференциально-диагностическую среду Бучина (хинозольная среда). На ней колонии С. diphthemae приобретают фиолетовый цвет вследствие восстановления индикатора, т.е. как цвет среды. А дифтероиды и палочки Гоффмана образуютколонии бесцветные или голубоватые на фиолетовом фоне среды.

На сывороточном и сахарном бульонах биовар gravis образует пленку и зернистый осадок; биовар mitis – диффузное помутнение; биовар in termedius^, - муть и зернистый осадок.

Чистую культуру коринебактерий выделяют на скошенных элективных средах Ру(свернутая лошадиная сыворотка) и Леффера (3 части бычьей сыворотки и 1 часть сахарного бульона), которые выглядят одинаково – косячки белого цвета. Можно использовать также и скошенный 20% сывороточный агар.

На средах Ру (Леффера) коринебактерии дифтерии через 8 – 14 часов вырастают в виде изолированных небольших (точечных) выпуклых желтовато-коричневых колоний с гладкой или слегка зернистой поверхностью, напоминающих «шагреневую кожу».

Ложнодифтерийные бактерии культивируются на всех средах, в том числе и на СПА, где образуют сухие мелкие колонии серого цвета, а на бульонах вызывают помутнение.

Ферментативные свойства.

Коринебактерии дифтерии всех 3-х биоваров не свертывают молоко, не разлагают мочевину, не образуют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитраты, восстанавливают теллурит калия в сульфид теллурита, вследствие чего на среде Клауберга их колонии становятся серыми или черными; все обладают ферментом цистиназой, что используется для дифференциации от непатогенных коринебактерий.

Все 3 биовара на обычном коротком «пестром» ряде Гисса ферментируют до кислоты глюкозу и мальтозу, но не ферментируют лактозу, маннит и сахарозу.

Однако для изучения ферментативных свойств коринебактерий используют жидкие среды (но без поплавков, т.к. ферментация проходит с образованием кислоты) и другой состав короткого пестрого ряда Гисса: сахароза, глюкоза, крахмал и мочевина.

Сахароза, глюкоза и крахмал до посева имеют светло-желтыйцвет, при ферментации до кислоты цвет меняется на розовый. Мочевина до посева темно-желтого цвета, при расщеплении цвет меняется на ярко красный (малиновый).

Все три биовара ферментируют глюкозу, а var gravis^, расщепляет и крахмал, что является дифференциальным признаком.

Биохимические признаки коринебактерий.

Токсинообразование и факторы патогенности.

Коринебактерии дифтерии (все три биовара) подразделяются на токсигенные и нетоксигенные разновидности.

Токсигенные дифтерийные штаммы образуют очень сильные экзотоксины. Токсигенность их связана с лизогенностью, т.е. наличием в геноме токсигенных штаммов умеренных фагов - профагов, которые вводят в геном дифтерийных бактерий гены токсогенности – (tox⁺- гены).

Классический международный эталонный штамм Парк – Вильямс 8 – продуцент экзотоксина – также является лизогенным и более 85 лет сохраняет способность к токсинообразованию.

Дифтерийный экзотоксин представляет собой сложный комплекс. Он получен в кристаллическом виде. Он неустойчив: легко разрушается под влиянием t⁰, света и кислорода воздуха. Сравнительно устойчив к действию ультразвука. После добавления к токсину 0,3 – 0,4% формалина и последующего выдерживания при 38-40⁰ С в течение 3-4 недель происходит превращение его в анатоксин, который обладает большей устойчивостью, чем исходный токсин.

Коринебактерии дифтерии var gravis^, наиболее высокотоксичны и обладают более выраженными инвазионными свойствами, чем var mitis^,.

Помимо экзотоксина коринебактерии дифтерии продуцируют гиалуронидазу, нейраминидазу, корд- фактор.

Непатогенные коринебактерии не токсигенны и агрессинов не выделяют.

Антигенная структура.

Коринебактерии дифтерии содержат липидные и полисахаридные межвидовые О – антигены и белковой природы специфические видовые К-антигены. По К-антигенам различают 58 сероваров коринебактерий дифтерии: 14-у var gravis. 40-у var mitis и 4-у var intermedius.

У коринебактерий дифтерии имеется 19 фаговаров, с помощью которых выявляют источники инфекции; фаговары учитываются также при идентификации выделенных культур.

Резистентность.

Коринебактерии дифтерии сравнительно устойчивые микробы. На средах Ру, Леффлера сохраняют жизнеспособность до 1 года; при комнатной t⁰ – до 2-х месяцев, долго сохраняются в пленках больных дифтерией; в воде – 6 – 20 дней, на детских игрушках – до 15 дней. Устойчивы к высушиванию и действию низких температур.

От действия t 60⁰C и обычных дезинфицирующих средств (1% фенол, сумма 1:1000) погибают в течение 10 минут.

Патогенность для животных.

В естественных условиях дифтерией болеют лошади, коровы, собаки, - инфицируются они от людей: больных и носителей. Однако домашние животные в качестве источников инфекции для заражения человека роли не играют.

Модели для культивирования С. diphtheriaе нет, но к токсину чувствительны морские свинки, кролики. У них при заражении развивается типичная картина токсикоинфекции. Доза 0,06 мкг токсина убивает морскую свинку весом 250г.

Эпидемиология, патогенез, клинические формы дифтерии и иммунитет.

Дифтерия – острая инфекция дыхательных путей, вызываемая

С. diphtheriaе, характеризующая фибринозным воспалением в зеве, гортани, трахее, реже в других органах и явлениями интоксикации.

Источник инфекции – больные люди и носители: реконвалесценты и здоровые носители.

Пути передачи:

1) воздушно-капельный и

2) воздушно-пылевой ® основные пути

3)контактно-бытовой – прямой контакт и непрямой: через белье, посуду, игрушки, пищевые продукты, книги (редко).

Восприимчивость к дифтерии высокая, наиболее чувствительны к возбудителю дети от 6 месяцев до 4 лет, однако в последние годы наблюдается «повзросление» болезни.

Заболевание чаще встречается осенью (скученность и снижение сопротивляемости организма под влиянием холода).

Входные ворота инфекции – слизистые оболочки зева, носа, глаза, уха, дыхательных путей, раневая поверхность, слизиста оболочка влагалища у девочек. На месте входных ворот наблюдается фибринозное воспаление, образуется характерная дифтеритическая пленка (серовато-белые наложения), которая с трудом отделяется от подлежащих тканей и содержит большое количество дифтерийных палочек. Это фибринозное воспаление иногда захватывает гортань, трахею, бронхи, и тогда вследствие их отека возникает затруднение дыхания и асфиксия (дифтерийный круп). Благодаря гиалуронидазе дифтерийные бактерии проникают в ткани и в кровь и начинают выделять экзотоксин, развивается токсинемия. Токсин поражает миокард, почки, надпочечники, нервную систему.

Существуют разнообразные по локализации формы дифтерии: дифтерия зева, носа, гортани, глаз, уха, кожи, ран, наружных половых органов и др. В 85% – 90% случаев наблюдается дифтерия зева. В Белоруссии на фоне всеобщей массовой активной иммунизации дифтерия зева – редкое заболевание; дифтерия других органов не встречается.

Инкубационный период – от 2 до 10 дней. Заболевание начинается с повышения температуры тела, появления боли при глотании, пленки на миндалинах, увеличения регионарных лимфоузлов. У взрослых дифтерия может протекать как лакунарная ангина. У детей раннего возраста в результате отека гортани развиваетсяасфиксия, которая может привести к смерти. Другие тяжелые осложнения, которые также могут явиться причиной смерти, - токсический миокардит, острая недостаточность гипофизарно-надпочечниковой системы, паралич дыхательных мышц.

Иммунитет.

Иммунитет при дифтерии носит антиинфекционный (антитоксический и антибактериальный) характер. После перенесенного заболевания вырабатывается стойкий иммунитет, повторные заболевания наблюдаются в 6 – 7% случаев.

Достаточно продолжительным является поствакцинальный иммунитет (до 3-5 лет). Степень напряженности иммунитета определяют по титру антитоксина в крови (наличие антитоксических антител) с помощью РНГА.

Методы микробиологической диагностики дифтерии.

Материалом для исследования служит отделяемое зева, носа, глаз, вульвы, уха, раны, кожи, а также трупный материал из дыхательных путей и других органов. При наличии дифтерийных пленок они также должны быть подвергнуты исследованию.

Забор материала от одного обследуемого производят стерильными «дифтерийными» тампонами (демонстрация тампонов).

После взятия материала тампоны должны быть немедленно доставлены в лабораторию, поскольку важно быстро произвести посев материала на специальные среды. Если время транспортировки материала превышает 24 часа, рекомендуется использовать транспортную среду с силикагелем.

P.S. Если тампоны доставлены в лабораторию без использования транспортной среды, их следует увлажнять несколькими каплями стерильной жидкой питательной среды (сывороточный или сахарный бульон).

Методы лабораторной диагностики:

1. Бактериологический – основной.

2. Микроскопический.

3. Серологический.

4. Кожно-аллергический.

5. Биологический.

6. ПЦР – диагностика.

Бактериологический метод проводится по этапам:

I этап.

1. Тампоном с пробкой на 2-х предметных стеклах делают мазки-отпечатки и

погружают его в пробирку с полужидкой средой обогащения для коринебактерий®37⁰С 24 часа.

2.Один мазок окрашивают по Леффлеру с целью обнаружения коринебактерий, а второй – по Граму для выявления других микроорганизмов, дают предварительный ответ.

3.Тампоном без пробки делают посев на среду Клауберга – на четверть чашки Петри (сектор 1). Далее стерильной петлей производят рассев на 3 сектора® 37⁰С 24-48 часа.

4.РИФ с материалом (экспресс – диагностика).

II этап.

1. Просматривают чашки с лупой в отраженном свете для изучения морфологии колоний. Подозрительные колонии выделяют на среде Ру (или Леффлера, или скошенном 20% сывороточном агаре) ®37⁰С 24часа.

PS. Мазки из колоний на среде Клауберга не делают, т.к. на ней бактерии дифтерии теряют свою специфическую морфологию, а при посеве на среды с сывороткой она восстанавливается.

2. С колониями ставят пробу на токсигенность методом диффузионной преципитации в геле ®37⁰С 24часа.

Методика:

В чашки Петри разливают 20% сывороточный агар 15 – 20мл (или среду для определения токсигенности). После застывания агара накладывают полоску стерильной фильтровальной бумажки (1,5 х 8 см), смоченную противодифтерийной антитоксической сывороткой (сыворотку разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 500 АЕ, бумажку смачивают 0,25 мл сыворотки, что соответствует 125 АЕ).Можно смачивать бумажку антитоксином противодифтерийным.

Испытуемую культуру засевают бляшками, диаметром 0,8 – 1 см на расстоянии 0,5 – 0,7 см от края полоски бумаги. Бляшку испытуемой культуры засевают между двумя бляшками контрольного заведомо токсигенного штамма коринебактерий. Заканчивают посев двумя контрольными бляшками.

Испытуемую культуру считают токсигенной, если линии преципитации четкие и сливаются с линиями преципитации контрольного (токсигенного) штамма.

Если линии преципитации перекрещиваются с линиями контрольного штамма, не доходят до них или вообще отсутствуют, выделенную культуру считают нетоксигенной.

III этап.

1. Учитывают результаты пробы на токсигенность и дают предварительный ответ.

2. Проверяют однородность чистой культуры, т.е. делают мазок со среды Ру, окрашивают по Леффлеру и микроскопируют (окраска по Леффлеру позволяет увидеть особенности морфологии коринебактерий).

3. Делают посев чистой культуры на короткий «пестрый ряд Гисса (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина) ®37⁰С 24 часа.

4. Делают посев чистой культуры в столбик среды Пизу для определения цистиназной активности ®37⁰С 24 часа.

5. Проводят серологическую идентификацию культуры путем постановки РА на стекле с поливалентной агглютинирующей сывороткой.

6. Повторяют пробу на токсигенность с чистой культурой ®37⁰С24 часа.

7.Делают пробу на чувствительность к антибиотикам: посев на 20% сывороточный агар ®37⁰С 24 часа.

IV этап.

1.Учитывают результаты всех тестов.

2. Выписывают окончательный ответ, например: «Выделены С. diphtheriaеvar gravis, токсигенный…».

Серологический метод.

Для сероидентификации дифтерийной культуры с помощью РА с поливалентной дифтерийной сывороткой в ходе бактериологического исследования. Для определения токсигенности дифтерийнойную культуру испытывают в РП в геле.

Аллергический метод.

Реакция Шика – внутрикожная проба с дифтерийным токсином, применяемая для установления противодифтерийного иммунитета. Для ее постановки внутрь кожи ладонной поверхности предплечья туберкулиновым шприцем вводят 0,2 мл стандартного дифтерийного токсина, содержащего 1/64 ДЛМ для морской свинки. Результаты учитывают через 72 – 96 часов.

У людей, не имеющих Ат против токсина или имеющих их мало, на месте введения образуется краснота и инфильтрат (положительная реакция); у людей в сыворотке которых содержатся антитоксические Ат в концентрации 1:30 АЕ и больше, инфильтрат не развивается или он меньше

1 см (отрицательная реакция).

Результаты реакции Шика используют для оценки коллективного иммунитета и проведения профилактических прививок.

Биопроба.

Используют для определения токсигенности дифтерийных культур на морских свинках, при помощи внутрикожного или подкожного введения культуры.

Внутрикожный метод: ставят на 2-х свинках, накануне одной из них вводят 100АЕ антитоксической сыворотки (контроль). Строго в/к вводят по 0,2 мл взвеси культуры (в 1мл около 100 млн. микробных клеток). Ответная воспалительная реакция развивается в течение 3-5 дней в виде гиперемии, инфильтрата и некроза. В качестве положительной реакции учитывается только некроз.

На одной свинке можно изучить до 10 культур, расстояние между пробами должно быть не менее 3 см. Чтобы предохранить свинку от гибели через 4 – 5 часов после введения культуры вводят 100 – 125 АЕ антитоксина. Эта доза не мешает течению реакции.

Подкожный метод: ставят тоже на 2-х свинках. Контрольной свинке вводят накануне 1000 АЕ антитоксической сыворотки внутрибрюшинно. Смывают культуру со свернутой сыворотки 3-5 мл ИХН и вводят подкожно по 0,2 мл обеим свинкам (приблизительно 10 –50 млн. микробов). При наличии токсигенной культуры подопытная свинка погибает в течение 2-5 дней, контрольная – выживает. На вскрытии подопытной свинки характерными являются инфильтрат на месте введения, увеличение и гиперемия надпочечников, экссудат в плевральной и брюшной полостях.

Эта проба наиболее надежна и дает четкий ответ во всех случаях, она допускает пользование смешанной культурой.

ПЦР применяют для дифференциальной диагностики.

Лечение и профилактика дифтерии.

Специфическое лечение дифтерии – немедленное введение антитоксической противодифтерийной сыворотки в дозах от 20 000 до

100 000 АЕ в зависимости от степени тяжести заболевания.

Параллельно назначают аминогликозиды и цефалоспорины, которые сокращают сроки бактериовыделения у реконвалесцентов и санируют организм здоровых бактерионосителей.

Специфическую профилактику проводят путем активной иммунизации. Для этого используют несколько препаратов:

АДМ – анатоксин – адсорбированный дифтерийный минимальный анатоксин, содержащий 5АЕ;

АДС – анатоксин – адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин;

АКДС – вакцина – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина.

Вакцинацию начинают проводить с 3-месячного возраста и далее, согласно, Календаря прививок.