Лекция Тема: «МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА»

Лекция

Тема: «МИКОБАКТЕРИИ ТУБЕРКУЛЕЗА»

План

1.Таксономия возбудителей туберкулеза.

2.Морфология, биологические свойства, тинкториальные особенности. Культивирование.

3.Основные виды микобактерий туберкулеза.

4. Токсинообразование. Источники инфекции и пути передачи заразного начала.

5. Патогенез и клинические формы туберкулеза, иммунитет. Особенности иммунитета.

6. Лечение и профилактика туберкулеза.

Туберкулез

Таксономия возбудителей туберкулеза.

Отдел Firmicutes, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium включает более 100 видов патогенных, условно-патогенных и непатогенных микобактерий.

Возбудителями туберкулеза человека являются следующие виды микобактерий:

·M. tuberculosis – человеческий вид

·M. bovis – бычий вид

·M. africanum – африканский вид

Наряду с ними, ряд видов являются потенциально патогенными, т. к. могут вызывать поражения легких, лимфоузлов и других органов:

M. intracellularae, M. avium (птичий вид), M. kansasii, M. acrofulaceum,

M. fortiutium. Есть быстрорастущие сапрофиты: M. pflei, M. smegmatis и другие.

Морфология и биологические свойства микобактерий туберкулеза.

Морфология.

M. tuberculosis - длинные (1-3,5 мкм.) , тонкие (0,2-0,4мкм.), слегка изогнутые палочки, грамположительные, неподвижные, спор и капсул не образуют. окрашиваются по Цилю-Нильсену в красный цвет. В мазках из мокроты больных располагаются поодиночке или скоплениями из 2-3 особей, а в препаратах из культуры склеиваются в жгуты-косы.

M. bovis- короткие толстые палочки с зернами, остальные свойства как у

M. tuberculosis.

M. africanum - тонкие длинные палочки, остальные свойства как у

M. tuberculosis.

У всех видов микобактерий полиморфизм проявляется в наличии наряду с типичными формами кокковидных, нитевидных и L-форм бактерий.

Культуральные свойства.

M. tuberculosis - облигатные аэробы, optim. t°роста 37°С, границы роста 24-42°С, рН 6,0-8.0.

Микобактерии туберкулеза - очень требовательные гетеротрофы и растут только на специальных яичных и полусинтетических жидких средах, содержащих набор солей. аминокислот, витаминов, необходимых для их жизнедеятельности. Элективными средами для них являются: свернутая сыворотка, 2-2% глицериновый агар, глицериново-картофельная среда, 4-55 глицериновый бульон, свернутые яичные среды - Петрова, Петраньяни, Дерсе, Гельберга, Виноградова, Левенштейна-Йенсена, Финна. Мордовского и другие.

На плотных элективных средах M. tuberculosis образуют шероховатые R-формы колонии, возвышающиеся, плотные, с утолщенной или морщинистой поверхностью, с тонкими неровными краями, кремового цвета; или сухие налеты (сливающиеся между собой гладкие S-формы колоний) кремоватого (слабо-желтого) цвета.

Первичный рост появляется на 21-45-60-ый день, а пассажные культуры растут быстрее - на 10-14-21-ый день.

ВОЗ рекомендовала в качестве стандартной использовать среду Левенштейна-Йенсена,т.к. на ней первичный рост появляется через 20-25 дней.

На среде Финна II рост БК появлвется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а процент выделения БК на 6-8% выше. чем на среде Левенштейна-Йенсена.

На жидких средах M. tuberculosis через 10-15 дней образуют тонкую, нежную пленку, которая постепенно утолщается, сморщивается, становится ломкой, приобретает морщинисто-бугристый вид и кремовый цвет, а бульон остается прозрачным; пленка по мере роста ползет вверх по стенкам пробирки. частично осаждаясь на дно.

M. bovisрастут на яичных средах без глицерина и дают первичный рост на 30-45-60-ый день в виде мелких, гладких, влажных колоний S-формы или R-формы, серого или белого цвета.

M. africanum растут на простых питательных средах, optim. t°роста 40- 42°С.

Ферментативные свойства.

У БК обнаружены протеолитические ферменты, расщепляющие белок в щелочной и кислой средах; они ферментируют алкоголь, глицерин, лецитин, фосфатиды, мочевину, никотиновую кислоту, разные углеводы; каталазоположительны.

Из биохимических свойств чаще всего определяют способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту - ниациновая проба Конно; редуцировать нитраты и разлагать никотинамид (никотинамидазная активность).

Ниациновая проба Конно (ниациновый тест): к культуре БК на жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора цианида калия (КСN) и 1 мл 5% раствора хлорамина Б. При наличии цианина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для обезвреживания цианистого калия после учета результатов реакции в пробирки добавляют 3-5 мл 10% раствора щелочи (NаОН).

Этот тест позволяет отличить БК человеческого типа, хорошо синтезирующих никотиновую кислоту, от микобактерий бычьего типа, образующих ее в минимальных количествах и дающих отрицательный результат.

Токсинообразование.

Продуцируют эндотоксин, который освобождается при распаде клеток.

Вирулентные штаммы возбудителей туберкулеза содержат и в процессе роста выделяют многие токсические вещества: фосфатиды, фтионовая кислота и воск Д, - вызывают образование специфических гранулем и подавляют активность фагоцитов; масляная, пальмитиновая, туберкулостеариновая, олеиновая жирные кислоты, - приводят к казеозному распаду клеточных элементов; особый гликолипид, или так называемыйкорд-фактор, склеивает микобактерии туберкулеза в жгуты и нарушает метаболизм клеток; сульфатиды и живые бактерии нарушают проницаемость лизосом; а С-микозиды создают защитный экран вокруг микобактерий.

Антигенная структура.

Антигенная структура микобактерий довольно сложная. Антигены связаны с клеточной стенкой, рибосомами, цитоплазмой, имеют белковую и липополисахаридную природу, участвуют в реакциях ГЗТ и ГНТ, обладают протективной активностью (протективные, защитные - Аг микробов, индуцирующие при введении в организм развитие эффективного приобретенного иммунитета к микробу, которому принадлежит этот Аг).

Человеческий вид серологически не отличается от бычьего и мышиного.

Резистентность.

Микобактерии устойчивы в окружающей среде: в пыли сохраняются 10 дней, на книгах, игрушках - до 3 месяцев, в воде - до 5 месяцев, масле - до 10 месяцев, сыре - до 8 месяцев, мокроте - до 10 месяцев. При кипячении погибают через 5 минут, длительно сохраняются при низких температурах. Обычные дезинфицирующие средства убивают их через сутки. Такая устойчивость микобактерий обусловлена высоким содержанием в их клетках липидов.

Эпидемиология, патогенез, клинические формы туберкулеза, иммунитет.

Эпидемиология.

Туберкулез распространен повсеместно, является социальной проблемой; инфицированность населения, заболеваемость и летальность довольно высоки, особенно в слабо развитых странах. Восприимчивость людей к туберкулезу всеобщая. На заболеваемость влияют социальные условия жизни населения. Наиболее уязвимы люди в пожилом и старческом возрасте.

Источником инфекции является больной человек, а также животные, птицы и холоднокровные.

Пути передачи инфекции: преимущественно воздушно-капельный, реже алиментарный и контактно-бытовой, возможно внутриутробное заражение плода через плаценту.

Эпидемическую опасность представляют только больные с открытой формой туберкулеза, когда происходит выделение возбудителя в окружающую среду.

Патогенез и клинические формы туберкулеза.

Туберкулез -первично-хроническое гранулематозное заболевание, при котором поражаются легкие, кишечник, почки, твердая мозговая оболочка, кости, кожа и другие органы и системы. Чаще всего у людей наблюдается туберкулез легких.

При заражении (инкубационный период 3-8 недель) на месте внедрения возбудителя формируется первичный туберкулезный комплекс (воспалительная или воспалительно-некротическая реакция), который может распространиться и придать болезни различные формы - от легких до тяжелых септических, с поражением различных органов и систем.

Для туберкулезной инфекции характерна реакция ГЗТ, выявляемая внутрикожным введением туберкулина (реакция Манту).

Особенность туберкулеза последних лет - развитие заболевания на фоне хронических вирусных инфекций и вторичных иммунодефицитных состояний, повышение удельного веса остро текущих прогрессирующих форм и диссеминированного туберкулеза.

Главной опасностью указанных форм туберкулеза является рассеивание возбудителя по всему организму, приводящее к трудно диагностируемым, запущенным формам туберкулеза.

Иммунитет.

Устойчивость к туберкулезу у людей высокая и обусловлена многими факторами неспецифической резистентности.

Приобретенный противотуберкулезный иммунитет непрочен, нестерилен и сохраняется только при наличии в организме микобактерий.

Методы микробиологической диагностики туберкулеза.

Материал для исследования: мокрота, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, моча, экссудат, отделяемое ран, гной, биопсийный и секционный материал.

Методы лабораторной диагностики:

1.Бактериологический -основной.

2.Микроскопический.

3.Биологический.

4.Кожно-аллергический.

5.Серологический.

6. ПЦР - диагностика

Наиболее надежным признаком диагностики заболевания туберкулезом является обнаружение Mycobacterium tuberculosis complex(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M.microti) в биологических жидкостях и в биоптатах тканей из очага поражения.

Микроскопический метод.

1.Бактериоскопия мазков, окрашенных по методу Циля-Нильсена, эффективна только при высокой концентрации микобактерий в исследуемом материале. Так, единичные палочки можно обнаружить в препарате, если их содержание не менее 10⁵ в 1 мл мокроты. Поэтому при небольшом содержании БК в материале применяют методы обогащения - гомогенизации и осаждения, или флотации.

Метод гомогенизации и осаждения.

К суточной мокроте добавляют равный объем 1% раствора едкого натра ( или антиформина) для гомогенизации, закрыв пробкой. встряхивают во флаконах со стеклянными бусами 10-15 минут. Центрифугируют, нейтрализуют кислотой и из осадка делают мазки.

Метод флотации.

Мокроту гомогенизируют и прогревают при 55°С 30 мин. на водяной бане. Добавляют 1-2 мл ксилола (или бензола, или бензина), дистиллированную воду, повторно встряхивают в течение 10 мин. и отстаивают 20 мин. при комнатной температуре. На поверхности образуется пена, которая состоит из всплывших капелек ксилола с адсорбированными микробами. Пипеткой или петлей из пенообразного слоя приготавливают мазок, несколько раз наслаивая материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обзжиривают эфиром, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

2.Применение люминесцентной микроскопии повышает число находок БК в материале. При этом пользуются объективом х 40 и окуляром х 10. При окраске аурамином БК светятся золотисто-зеленым светом, а при окраске акридином -оранжево-красным.

Примечание. Микроскопическое исследование является ориентировочным и позволяет судить лишь о наличии кислотоустойчивых бактерий в материале без определения видовой и типовой принадлежности.

Бактериологический метод.

Золотым стандартом современной лабораторной диагностики туберкулеза остается бактериологический метод. Внедрение бактериологический метода роста культуры на жидкой селективной среде позволяет получить положительный результат на 7-ой день, отрицательный результат - к 42-ому дню от начала анализа. При положительном результате необходимо выполнить бактериологическую идентификацию вида возбудителя на твердых ростовых средах. В связи с этим бактериологический анализ на микобактерии остается весьма продолжительным лабораторным исследованием.

Материал перед посевом подвергают кислотно-щелочной обработке для уничтожения банальной микрофлоры. Так, к мокроте приливают двойной объем 6% серной кислоты, встряхивают 10 мин. и центрифугируют, а к фекалиям на 3 часа добавляют 4% раствор гидроксида натрия и центрифугируют. Можно обрабатывать материал равным объемом трифосфата ацетилцистеина 20 мин. (пробирку в процессе обработки встряхивают) или 10% раствором тринатрийфосфата при 37°С 20-24 часа.

Полученные осадки нейтрализуют несколькими каплями 3% раствора натрия гидроксида (мокрота) и 8% серной кислоты (фекалии) и перед посевом тщательно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида.

После нейтрализации материал засевают в 3-6 пробирок со средой Левенштнйна-Йенсена. Посевы инкубируют при 37°С в течение 4-6 недель (иногда 2-3 месяца). Контролируют каждые 5 дней. Во избежание высыхания ватные пробки пробирок после посева заливают парафином.

Если рост появляется до 5-го дня, дают отрицательный ответ на туберкулез (быстрорастущие микобактерии).

Если рост микобактерий отмечается после 5-7-го дня, проводят идентификацию культуры:

1.Изучают культуральные свойства выделенной культуры (характер роста, форму колоний, образование пигмента).

2.Делают мазок, окрашивают по Цилю-Нильсену, т. е. проверяют однородность культуры.

3.Проводят определение содержания ниацина (синтез никотиновой кислоты), т. е. ниациновый тест (он положительный только у человеческого типа микобактерий).

4.Определяют никотинамидазную активность.

5.Определяют нитратредуктазную активность (восстановление нитратов).

6. Определяют корд-фактор.

7.Ставят биопробу: определяют вирулентность выделенной культуры на морских свинках и кроликах (1-1,5 мл п/к в область паха).

8. Определяют чувствительность выделенной культуры к противотуберкулезным препаратам методом разведений (абсолютных концентраций) на плотных средах (среде Левенштейна-Йенсена).

Методы ускоренной диагностики.

Для ускоренной диагностики используют методы получения микрокультур на предметных стеклах: метод Прайса и метод Школьниковой.

Метод микрокультур Прайса: на нескольких предметных стеклах (ближе к одному из концов) делают толстые мазки из исследуемого материала, высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6% раствором серной кислоты, промывают стерильнымИХН и опускают во флаконы с жидкой питательной средой Прайса (цитратная кровь) и ставят в термостат при 37°С. Через 72 часа, 7 и 14 дней стекла извлекают, фиксируют, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют. Вирулентные штаммы через 72 часа, 7 и 14 дней образуют микрокультуры микобактерий, имеющие вид «жгутиков». или «косичек», «змейки» (корд-фактор).

Метод Школьниковой: отличается от метода Прайса тем, что питательной средой служит гемолизированная цитратная кровь в разведении 1:4 - 1:8.

Примечание. Для быстрой дифференциации возбудителя туберкулеза человека от остальных микобактерий рекомендуют посев на среду Левенштейна с 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл салицилового натрия. Возбудители туберкулеза на этой среде не растут.

Кожно-аллергический метод.

Проба Манту- кожно-аллергическая проба с туберкулином для выявления сенсибилизации организма людей (и животных) к возбудителю туберкулеза. Применяют при отборе контингентов людей для ревакцинации вакциной БЦЖ, определения частоты инфицированности населения туберкулезом. эффективности вакцины БЦЖ, установления виража.

Пробу Манту ставят с очищенным белковым препаратом туберкулина (РРД), активность которого определяют по туберкулиновому стандарту (РРД-S) и выражают в туберкулиновых единицах (ТУ).

Пробу Манту обычно делают с 5 ТУ (средняя концентрация). Дозу туберкулина, разведенную в стерильном карболизированном (0,25%) физрастворе, в объеме 0,1 мл с соблюдением правил асептики вводят внутрь кожи средней трети ладонной поверхности предплечья. Результаты учитывают через 48 и 72 часа. За положительную реакцию принимают инфильтрат диаметром более 10 мм, за отрицательную -полное отсутствие инфильтрата и гиперемии.

Серодиагностика.

В серодиагностике туберкулеза используют РСК и РНГА (реакция Миддлбрука-Дюбо). Метод проводится ограниченно. т. к. положительные результаты могут быть при инфицировании БК. при вакцинации БЦЖ и при активном туберкулезном процессе в организме.

Лечение и профилактика туберкулеза.

Средства специфической терапии:

- противотуберкулезные препараты I ряда: изониазиды, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид, рифампицин;

- противотуберкулезные препараты II ряда: канамицин, циклосерин, тиоацетазон (тибон), этоксид, этионамид.

Средства специфической профилактики:

- живая вакцина БЦЖ – BCG (Bacille Calmette – Guerin – бациллы Кальметта-Герена);

- живая вакцина БЦЖ-М (щадящая).