Занятие Тема: «Микробиологическая диагностика сифилиса».

Тема: «Микробиологическая диагностика сифилиса».

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению морфологических и биологических свойств возбудителя сифилиса.

2. Изучить правила забора, хранения, транспортировки, регистрации, подготовки материала к исследованию при сифилисе.

3. Овладеть методиками постановки:

- реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном;

- качественный РСК (реакции Вассермана).

4. Изучить методики постановки:

- количественную методику постановки реакции Вассермана;

- реакцию иммобилизации трепонем (РИТ);

- ИФА с целью диагностики сифилиса.

5. Закрепить практические навыки по технике приготовления нативных препаратов и темнопольной микроскопии.

IIСамостоятельная работа

Задание 1.

Изучите морфологию и тинкториальные свойства бледной трепонемы по таблицам и слайдам. Зарисуйте мазки в дневник и подпишите.

Задание 2.

Изучите правила забора, хранения, транспортировки, регистрации, подготовки материала к исследованию при сифилисе (см. Приложение 1).

Задание 3.

Проведите микроскопическое исследование «материала при сифилисе», сделайте нативный препарат «раздавленная капля» или «висячая капля» из бульонной культуры. Изучите его в темном поле зрения, зарисуйте в дневник и сделайте заключение.

Заключение:

Задание 4.

Поставьте реакцию микропреципитации на стекле с кардиолипиновым антигеном для реакции микропреципитации и сывороткой обследуемого, учтите результат и сделайте заключение.

Принцип РМП – при добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.

Приготовление антигенной эмульсии:

1. Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина, их растворяют нагреванием ампул в термостате или на водяной бане при 37⁰ или 56⁰соответственно.

2. На 50 исследований требуется 1мл кардиолипинового антигена. В пробирку вносят сухой пипеткой 1 мл антигена, добавляют равный объем ИХН, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин-хлорида.

3. Пробирку плотно закрывают резиновой пробкой, и содержимое взбалтывают, опрокидывая пробирку, до полного ресуспендирования.

Полученная эмульсия готова к употреблению.

4. Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4⁰С не более недели, а при добавлении раствора мертиолата – в течение 2 недель.

5. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови.

Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой.

Алгоритм

качественной методики постановки реакции микропреципитации

с кардиолипиновым антигеном для РМП:

1. На обычное стекло или углубление пластинки из плексигласа (лунку) пастеровской пипеткой наносят 3 капли нативной плазмы или инактивированной сыворотки и нумеруют ее соответственно списку в регистрационном журнале.

2. Затем добавляют 1 каплю антигенной эмульсии.

3.Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины в течение 5 минут.

4. Затем в каждую лунку добавляют по 3 капли изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатнойтемпературе на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28⁰С).

5.Результаты учитывают после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

6. Результаты реакции учитываются при освещении не ниже 300 люкс.

При исследовании активной плазмы или инактивированной сыворотки от больных сифилисом наблюдается положительная реакция в виде выпадения хлопьев разной величины, а с активной плазмой или инактивированной сывороткой от здоровых лиц наблюдается отрицательная реакция в виде опалесценции.

7. Обязательно ставится РМП со всеми тремя контрольными сыворотками – положительной, слабоположительной и отрицательной.

Данные сыворотки предназначены для контроля правильности результатов при постановке реакции стандартного серологического комплекса на сифилис.

Результат:

Заключение:

Задание 5.

Поставьте реакцию Вассермана с трепонемным ультраозвученным и кардиолипиновым антигенами (качественную РСК) и сывороткой обследуемого, учтите результат и сделайте заключение.

Принцип RW

Реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с кардиолипиновым антигеном.

Специфические антитрепонемные антитела вступают в соединение со специфическими антигенами (ультраозвученный трепонемный антиген), Образовавшиеся комплексы антиген-антитело сорбируют вводимый в реакцию комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (гемолитическая сыворотка+эритроциты барана).

Подготовка ингредиентов для постановки RW

1. Инактивированные сыворотки крови: испытуемую, положительную, слабоположительную и отрицательную разводят стерильным ИХН 1:5 в отдельных серологических пробирках.

2. Антиген трепонемный разводят по титру (растворить в 5 мл 0,85% раствора хлорида натрия).

3. Антиген кардиолипиновый для РСК разводят по титру 1:500.

4. Комплемент. Исходным его разведением является разведение 1:10. Титрование комплемента для расчета его рабочей дозы проводится по общепринятой схеме.

Допустим, что 1 полная единица комплемента равна 0,07 мл разведения 1:10. Так как связывание ведется при +37⁰С, то «рабочая доза» комплемента берется в основной опыт в количестве 1 полной единицы, т.е. 0,07мл разведения комплемента.

Расчет общего количества комплемента:

а) всего в опыте участвует 15 пробирок (8 опытных и 7 контрольных);

б) 0,07мл х 15 = 1,05 мл комплемента 1:10 нужно взять на все пробирки (на всю РСК);

в) 0,25мл – 0,07мл =0,18мл ИХН нужно добавить в одну пробирку, чтобы объем комплемента составил 0,25мл;

г) 0,18мл х 15= 2,7мл ИХН нужно добавить во все пробирки;

д) «рабочая доза» комплемента = 1,05 мл комплемента 1:10+2,7мл ИХН ≈ 1 мл комплемента 1:10+2,7мл (3) ИХН – это и будет общий объем комплемента на всю РСК. «Рабочая доза» комплемента делается в отдельной пробирке.

5.Эритроциты барана отмывают несколько раз физраствором (центрифугируют консервированную кровь при 2000 об/мин с ИХН 2-5 раз, пока надосадочная жидкость станет бесцветной) и готовят 3% взвесь суспензируя 3 мл осадка эритроцитов в 97 мл ИХН 3% взвесь эритроцитов годна в течение дня.

6.Гемолитическую сыворотку разводят в 3 раза меньше титра, указанного на этикетке.

7.Гемолитическую систему готовят, смешивая равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, и инкубируют ее в термостате при 37⁰С 45 мин.

Качественная методика постановки реакции Вассермана

Заключение:

Задание 6

Изучите количественную методику постановки реакции Вассермана.

Количественная методика постановки реакции Вассермана

Задание 7

Изучите методику постановки реакции иммобилизации трепонем (РИТ).

РИТ в диагностике сифилиса считается наиболее специфичной реакцией. Она основана на старом наблюдении Д. К. Заболотного и П. П. Маслаковца (1907), которые указали на потерю подвижности у бледной спирохеты при добавлении к ее культуре сыворотки крови больных сифилисом в присутствии комплемента.

Алгоритм постановки РИТ

1.Взвесь спирохет получают из размельченного яичка кролика, зараженного сифилисом, и сохраняют в специальной среде, не угнетающей подвижности трепонем.

2. В пробирку вносят 1,7мл взвеси тканевых трепонем, добавляют 0,2мл испытуемой сыворотки, 0,1 мл свежего комплемента (опыт).

3. В одну контрольную пробирку вместо испытуемой сыворотки наливают сыворотку крови здорового человека, остальные ингредиенты те же самые, что и в опытной пробирке (1-ый контроль).

4. Во вторую контрольную пробирку вместо свежего комплемента добавляют инактивированный комплемент, остальные ингредиенты те же, что и в опытной пробирке (2-ой контроль).

5. Все (три) пробирки помещают в сосуд (эксикатор или анаэростат), заполненный смесью газов: 1 объем углекислоты и 19 объемов азота; сосуд в свою очередь ставят в термостат при 37⁰С.

6. Из каждой пробирки делают препарат «раздавленная капля» и под микроскопом в темном поле зрения определяют количество подвижных и неподвижных трепонем сначала в капле с активным, а потом с инактивированным комплементом.

Т_к-Т_о

Х = -------- х 1000,

Т_к

где: Т_к – число подвижных трепонем в контроле с инактивированным комплементом;

Т_о - число подвижных трепонем в опыте с активным комплементом;

8. Результат реакции считают положительным, если процент иммобилизации выше 50, слабоположительным – от 31 до 50, сомнительным – от 21 до 30 и отрицательным – ниже 20.

Примечание: РИТ, несмотря на специфичность, в связи с трудоемкостью постановки к применению в широкой практике не рекомендуют.

Задание 8

Изучите методику постановки ИФА с целью диагностики сифилиса по Инструкции по применению тест-системы.

Оценка _____________________

Подпись преподавателя____________________

Приложение 1

Правила

забора, хранения, транспортировки и подготовки

к исследованию материала при сифилисе

1.Отделяемое из твердого шанкра берут для микроскопического исследования. Оно должно быть свободно от гноя, слизи, клеток эпителия и других примесей. Для получения отделяемого необходимо тщательно промыть язву или эрозию ваткой, смоченной изотоническим раствором хлорида натрия, избегая сильного растирания и кровотечения. Очищенную поверхность язвы осторожно раздражают прокаленным и остуженным металлическим шпателем или лопаточной. Можно сжать края шанкра пальцами (в перчатках) или пинцетом. Отделяемое появляется не сразу, если оно происходит из глубины язвы, к чему следует стремиться. Каплю отделяемого набирают в пастеровскую пипетку и наносят на тонкое (не толще 1,2 мм) предметное стекло, хорошо очищенное и обезжиренное. Покрывают покровным стеклом и микроскопируют в темном поле рения. Сифилитическая спирохета отличается ровными завитками, плавными маятникообразными движениями и сгибанием и разгибанием под углом, и она тоньше большинства других трепонем, которые встречаются в отделяемом из язвы в ротовой полости. При необходимости использовать окрашенный препарат применяют окраску по Романовскому-Гимзе: бледная трепонема окрашивается в бледно-розовый цвет.

2.Содержимое розеол, везикул, папулсобирают стерильным тампоном или стерильной пипеткой. Делают мазок на предметном стекле и микроскопируют.

3.Получение сывороток крови.

Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи.

Нельзя брать кровь: у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов, перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, беременных в последние 10 дней беременности, рожениц в первые 10 дней после родов, новорожденных в первые 10 дней жизни.

Кровь из локтевой вены в количестве 7-10 млберут в сухую чистую пробирку. Пункцию производят стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь берут из надреза пятки узким скальпелем.

В лабораторию кровь должна быть доставлена не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при 4⁰С.

Доставленную в лабораторию кровь в день ее взятия помещают в термостат при 37⁰С на 15-30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и центрифугируют 15 минут при 1000об/мин. Над сгустком образуется прозрачная сыворотка крови, которую при помощи пипетки с резиновым баллоном без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотки крови примеси эритроцитов ее центрифугируют и отделяют от них.

Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и помещают в холодильник при 4⁰С. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят в другую пробирку.

Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют в сухожаровом инактиваторе или водяной бане в течение 30 минут при 56⁰С для уничтожения естественного комплемента и стабилизации глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови.

Инактивированные сыворотки крови могут храниться в холодильнике 5-6 дней. Для более длительного хранения к сыворотке крови после инактивации добавляют сухую борную кислоту (из расчета 2%), что позволяет ею пользоваться в течение 3-4 недель, или замораживают в морозильной камере холодильника на тот же срок, не допуская повторного замораживания и оттаивания.

Сыворотки крови, ранее инактивированные, в день постановки реакции должны быть повторно прогреты в течение 15 минут при 56⁰С.

В лаборатории исследуется весь биоматериал, поступивший для работы, но результаты (КСР) по желтушным, хилезным, гемолизированным и проросшим сывороткам не выдаются. Кровь таких лиц обязательно исследуется повторно с соблюдением всех требований по взятию, хранению и транспортировке.

4. Получение плазмы крови

Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки «К», возвращают во флакон раствор до метки «25», а оставшийся цитрат выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови до метки «К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают пастеровской пипеткой для проведения исследования.